竹节参总皂苷对脂多糖诱导的BV2细胞炎症反应的影响及机制研究

郑宏 ，王蕾 ，邹海艳

1.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700；2.首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京 100069

神经炎症是影响神经退行性疾病进展的重要因素，其主要表现有小胶质细胞激活和脑微环境中神经炎症介质大量产生。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的先天固有免疫细胞，占脑细胞总数的10%～15%，与外周巨噬细胞和淋巴细胞作用类似，能够作为脑的免疫屏障抵抗疾病和外界刺激。小胶质细胞可以分为促炎型M1型和抑炎型M2型。M1型主要分泌促炎介质，如白细胞介素（IL）-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α，一氧化氮（NO）等，M2型能分泌IL-4、IL-10、转化生长因子（TGF）-β等抗炎因子[1]。正常状态下，M1/M2处于动态平衡，从而维持细胞内环境稳态[2]。在脑缺血、神经退行性疾病、感染等病理条件下，小胶质细胞迅速活化，转化为M1型，导致M1/M2比例失衡，产生大量促炎介质，破坏血脑屏障并直接损伤神经元或引起其他继发性损伤[3-4]。因此，抑制其过度活化引起的炎症反应可作为治疗和缓解神经退行性疾病和脑损伤的重要途径[5-7]。

自噬是存在于真核细胞内的保守的降解机制，通过溶酶体机制降解受损或不必要的细胞质内容物。自噬在许多生理和病理过程中起重要作用，如抑制细胞凋亡、调节免疫反应和细胞产物再循环[8-10]。研究表明，神经退行性疾病与自噬失调有关[11]，此类疾病多伴有蛋白质聚集和炎症反应，增强自噬可以减少蛋白质蓄积[12]。因此，上调自噬成为治疗神经退行性疾病的潜在靶点，同时可以抑制炎症反应发生，对于抑制细胞凋亡、延缓神经元变性有重要意义。

竹节参为五加科人参属植物竹节参Panax japonicusC. A. Mey.的干燥根茎，具有散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、补虚强壮功效，民间常用于治疗跌打损伤、骨关节疾病、病后虚弱。其主要成分竹节参总皂苷（TSPJ）对中枢神经系统炎症[13-14]及风湿性关节炎、类风湿关节炎[15-16]等具有较好的抗炎活性。其抗炎作用主要表现在抑制炎症因子释放、降低肿胀程度和毛细血管通透性[17]。课题组前期研究发现，TSPJ对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠具有神经保护作用，能降低小鼠神经功能评分，改善脑和脊髓炎性浸润[18]。本研究通过脂多糖诱导小鼠小胶质细胞BV2体外炎症模型，进一步揭示TSPJ抗炎的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞

小鼠小胶质细胞BV2购于国家生物医学细胞资源库，编号1101MOU-PUMC000063。

1.2 药物及制备

竹节参药材购于湖北省恩施土家族苗族自治州，经首都医科大学中医药学院中药资源教研室李佳副教授鉴定，符合2020年版《中华人民共和国药典》规定。取竹节参药材8 kg，加入80%乙醇浸泡24 h，回流提取2次，第1次加8倍量溶剂提取2 h，第2次加6倍量溶剂提取2 h，过滤，合并滤液，55 ℃减压回收至无醇味，得糖浆状提取物。将提取物加适量水分散，用等量石油醚反复萃取至石油醚层近无色；水层继续用等量水饱和正丁醇反复萃取至正丁醇层近无色，分取正丁醇提取液，减压回收至黏稠状，加80%乙醇溶解，加5倍体积丙酮，搅匀，放置过夜，4 000 r/min离心10 min，分离沉淀，用少量丙酮洗涤，放于真空干燥箱内干燥。得到TSTJ提取物1 455 g，提取率为18.2%。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清（FBS），美国Corning，货号35-076-CV；DMEM高糖培养基，美国Hyclone，货号SH30022.01B；100×青链霉素，美国Corning，货号15140-122；脂多糖（LPS），美国Sigma，货号PB10443；MTT，上海碧云天生物，货号ST316；DAPI，美国SouthernBiotech，货号0100-20；Griess 试剂盒，上海碧云天，货号S0023；TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10 ELISA 试剂盒，北京联科生物，货号分别为EK282、EK201B、EK204、EK210，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），上海阿拉丁，货号M 129496；Akt 抑制剂GSK690693，美国TargetMol，货号T6285；RIPA裂解液，北京索莱宝，货 号 R0010-100； Arginase-1、 CD86、 Beclin1、mTOR、p-mTOR 抗体，英国Abcam，货号分别为ab91279、ab119857、ab207612、ab32028、ab 109268；LC3抗体，美国Invitrogen，货号PA 116931；Akt抗体，美国CST，货号C67E7；p-Akt抗体，美国CST，货号S473；β-actin抗体，美国Proteintech，货号66099-1。

ESCD AC2-4S1超净生物安全柜（美国Thermo公司），371型二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo公司），XDTD-8222恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），LWD300-38LTI倒置显微镜（上海测维光电有限公司），SpectraMax Plus 384 全波长酶标仪（美国Molecular Devices公司），ETS-D5磁力搅拌器（德国IKA公司），Mini-PROTEAN®Tetra电泳槽（美国Bio-Rad公司），小型Trans-Blot®转印槽（美国Bio-Rad公司），PowerPacTM电泳仪电源（美国Bio-Rad 公司），Heros B10 微量台式离心机（德国Sartorius Sigma 公司），恒温金属浴（北京昊诺斯公司），FX6 XT化学发光成像系统（法国Vilber Fusion公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

从-80 ℃冰箱取出细胞，迅速置于37 ℃水浴中解冻2 min，1 000 r/min离心5 min，沉淀加入完全培养基（含20%FBS、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL）1 mL吹打成细胞悬液，将细胞悬液接种至培养瓶中，补充完全培养基至5 mL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次。

2.2 药物浓度筛选

精密称取TSPJ粉末8 mg，加入PBS定容至2 mL，超声使其完全溶解，配制成4 mg/mL贮备液，临用前用DMEM高糖培养基将TSPJ贮备液稀释成浓度分别为5、10、25、50、100 μg/mL溶液，0.22 μm滤膜过滤，即得。用DMEM培养基将LPS稀释至10 μg/mL，用0.22 μm滤膜过滤，即得。

取对数生长期BV2细胞，调整密度为2×105个/mL，按每孔100 μL接种至96孔板，将细胞分为正常组和模型组，每组6个复孔，另设空白组调零。培养箱培养24 h后，吸去原培养基，加入浓度分别为0、5、10、25、50、100 μg/mL的TSPJ溶液（无血清培养基配制）孵育2 h。模型组加入终浓度为1 μg/mL的LPS溶液，于培养箱中继续培养24 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，混匀，培养箱孵育4 h。吸去培养基，加入DMSO 100 μL，混匀，酶标仪波长490 nm测定吸光度（OD值），计算细胞存活率。存活率（%）=（实验组OD值-空白组OD值）÷（正常组OD值-空白组OD值）×100%。

2.3 Griess法检测一氧化氮含量

取对数生长期BV2细胞，调整密度为2×105个/mL，按每孔500 μL接种于24孔板，将细胞分为正常组、模型组和TSPJ低、中、高浓度组，每组4个复孔，培养24 h 后，加入浓度分别为5、10、25 μg/mL的TSPJ溶液孵育2 h，正常组及模型组替换成无血清培养基。除正常组外，各组加入一定量LPS 溶液使其终浓度为1 μg/ mL，于37 ℃、5%CO2培养箱继续培养24 h。取50 μL 上清液至新的96 孔板内，分别加入50 μL Griess试剂Ⅰ和试剂Ⅱ，混匀，酶标仪波长540 nm检测各孔OD值，根据标曲线计算上清液NO含量。

2.4 ELISA检测

细胞按“2.3”项下方法处理后，采用ELISA检测上清液TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量，严格按试剂盒说明书操作。

2.5 免疫荧光染色

将灭菌的圆形玻片放入24孔板内，加入0.1 μg/mL多聚赖氨酸包被，37 ℃放置30 min，ddH2O冲洗2次，无菌条件下晾干备用。取对数生长期BV2细胞，将细胞密度调整为2×105个/mL，每孔500 μL接种于24孔板，将细胞分为正常组、模型组和TSPJ组（25 μg/mL），每组3个复孔，其余步骤同“2.3”项下操作。弃去培养基，预冷PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次，0.3%Triton X-100通透10 min，PBS清洗，5%BSA封闭30 min，滴加Arginase-1一抗（1∶200）、CD86 一抗（1∶100）、LC3 一抗（1∶200），湿盒内4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，滴加山羊抗兔Alexa Fluor 594（1∶400）和兔抗大鼠Alexa Fluor 488（1∶200），常温避光孵育30 min，滴加DAPI染细胞核15 min，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，用Image J 1.8.0软件统计荧光强度，以各组荧光强度与正常组荧光强度百分比作为最终结果。

2.6 Western blot检测

取对数生长期BV2细胞，调整密度为2×105个/mL，以2.5 mL/孔接种至6孔板，将细胞分为：①正常组、模型组、TSPJ 组（25 μg/mL）、3-MA 组（1 mmol/L）和TSPJ+3-MA 组（25 μg/mL TSPJ+1 mmol/L 3-MA）；②正常组、模型组、TSPJ 组（25 μg/mL）、GSK 组（10 nmol/L）和TSPJ+GSK组（25 μg/mL TSPJ+10 nmol/L GSK690693），每组4个复孔。培养24 h，待细胞贴壁后将培养基吸出，正常组和模型组加入DMEM培养基，其余组分别加入相应溶液孵育2 h。除正常组外，各组加入LPS使其终浓度为1 μg/mL，置于培养箱中继续培养24 h。

使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为3 μg/μL，加入Loading Buffer，95 ℃金属浴3～5 min使蛋白变性。制胶，上样，电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。①组滴加LC3一抗（1∶500）、Beclin1一抗（1∶2 000）、p62 一抗（1∶10 000）和β-actin 一抗（1∶20 000），②组滴加p-Akt一抗（1∶1 000）、Akt一抗（1∶1 000）、p-mTOR一抗（1∶5 000）、mTOR一抗（1∶5 000）和β-actin 一抗（1∶20 000），4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜3次，每次5 min，加HRP标记山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG（1∶20 000），室温孵育1 h，TBST洗膜4次，每次5 min。按1∶1配制ECL发光液，化学发光成像系统成像，Image J 1.8.0软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值表示各蛋白相对表达量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 竹节参总皂苷对细胞存活率的影响

在设定的TSPJ浓度范围内，LPS刺激后细胞存活率无明显变化，当TSPJ浓度超过50 μg/mL时，细胞存活率明显降低（P＜0.01），表明该浓度对细胞有毒性作用，因此选择TSPJ浓度分别为5、10、25 μg/mL进行后续实验。见图1。

注：与相应TSPJ浓度为0比较，##P＜0.01图1 不同浓度TSPJ对BV2细胞存活率的影响（±s，n=6）

4.2 竹节参总皂苷对细胞上清液一氧化氮含量的影响

与正常组比较，模型组细胞上清液NO含量明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，TSPJ中、高浓度组细胞上清液NO含量明显减少（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 各组BV2细胞上清液NO含量比较（±s，μmol/L）

表1 各组BV2细胞上清液NO含量比较（±s，μmol/L）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.3 竹节参总皂苷对细胞上清液炎症因子含量的影响

与正常组比较，模型组细胞上清液促炎因子TNF-α、IL-1β含量明显增加，抗炎因子IL-4、IL-10含量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，TSPJ高浓度组细胞上清液TNF-α、IL-1β含量明显减少，IL-4、IL-10 含量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组BV2细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量比较（±s，pg/mL）

表2 各组BV2细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10含量比较（±s，pg/mL）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.4 竹节参总皂苷对细胞Arginase-1、CD86、LC3 蛋白表达的影响

CD86 蛋白与M1 型小胶质细胞表型相关，Arginase-1蛋白与M2型小胶质细胞表型相关。免疫荧光染色显示，与正常组比较，模型组BV2细胞CD86表达明显升高，Arginase-1表达明显降低（P＜0.01），M1/M2平衡破坏；与模型组比较，TSPJ组BV2细胞CD86表达明显降低，Arginase-1 表达明显升高（P＜0.01），M1/M2平衡有所恢复。见图2、表3。

表3 各组BV2细胞CD86、Arginase-1表达比较（±s，%）

表3 各组BV2细胞CD86、Arginase-1表达比较（±s，%）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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图2 各组BV2细胞CD86、Arginase-1表达（免疫荧光染色，×400）

与正常组比较，模型组细胞LC3 表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，TSPJ组细胞LC3表达明显升高（P＜0.01）。见图3、表4。

表4 各组BV2细胞LC3表达比较（±s，%）

表4 各组BV2细胞LC3表达比较（±s，%）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

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图3 各组BV2细胞LC3阳性表达（免疫荧光染色，×400）

4.5 竹节参总皂苷对细胞自噬相关蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组细胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达明显降低（P＜0.01），p62蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，TSPJ组细胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达明显升高（P＜0.01），p62蛋白表达明显降低（P＜0.01），3-MA组细胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达明显降低（P＜0.01），p62 蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与TSPJ组比较，TSPJ+3-MA组细胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达明显降低（P＜0.01），p62蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与3-MA组比较，TSPJ+3-MA组细胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达明显升高（P＜0.01），p62蛋白表达明显降低（P＜0.01）。见图4、表5。

表5 各组BV2细胞Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表达比较（±s）

表5 各组BV2细胞Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与TSPJ组比较，△△P＜0.01；与3-MA组比较，▲▲P＜0.01

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注：A.正常组；B.模型组；C. 3-MA组；D. TSPJ组；E. TSPJ+3-MA组图4 各组BV2细胞Beclin1、LC3、p62蛋白免疫印迹

4.6 竹节参总皂苷对细胞Akt/mTOR 通路蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组细胞p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，TSPJ组、GSK组和TSPJ+GSK组细胞p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05）；与TSPJ组比较，TSPJ+GSK组细胞p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与GSK组比较，TSPJ+GSK组细胞p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。各组Akt、mTOR表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5、表6。

表6 各组BV2细胞p-Akt、p-mTOR蛋白表达比较（±s）

表6 各组BV2细胞p-Akt、p-mTOR蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与TSPJ组比较，△△P＜0.01；与GSK组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

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图5 各组BV2细胞p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白免疫印迹

5 讨论

CNS损伤时，可刺激小胶质细胞极化，引起细胞形态、免疫学表型及功能的改变。目前已知的小胶质细胞极化有2种状态，即经典极化态（M1型）和选择性极化态（M2型）。诱导M1型的信号分子较多，其中最经典的途径是LPS激活[19]，外周血液中的活性成分如补体、免疫球蛋白等亦可诱导。该过程需要多条信号通路参与，其中以核因子-κB（NF-κB）信号通路最为主要。极化后M1 型小胶质细胞高表达CD86、MHC-Ⅱ、CD11b、CD16等，并释放一系列炎症因子、趋化因子、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、NO等参与机体炎症反应[20-21]。M2型小胶质细胞高表达YM1、Arginase-1、CD206、血红素氧合酶-1和胰岛素样生长因子-1等，其中Arginase-1与修复再生能力有关，是M2型小胶质细胞的标志物[22]。M2型小胶质细胞主要分泌抗炎因子（IL-10、IL-13、TGF-β）及神经营养因子如胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子等减轻炎症反应，钝化促炎态细胞，促进损伤修复，保护神经元，从而维持中枢内环境稳定[23]。

研究发现，TSPJ 对LPS 诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7 炎症有保护作用[24]，能减少NO、IL-1β、TNF-α分泌，降低诱导型一氧化氮合酶、IL-1β、TNF-α mRNA表达和NF-κB活化。本研究通过体外实验发现，高浓度TSPJ 能减少LPS 诱导的BV2 细胞促炎因子TNF-α、IL-1β分泌，增加抗炎因子IL-4、IL-10分泌，促进BV2细胞由M1型向M2型转化，维持M1/M2平衡。因此后续实验选择TSPJ高浓度进行机制研究。

自噬是将一些需降解的蛋白质和细胞器等胞质成分包裹，并最终运送至溶酶体降解的过程。正常情况下，细胞很少发生自噬，当存在诱发因素，细胞保持基础的自噬活性即可维持自身稳定。LC3是自噬起始因子，存在LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2种形式，LC3Ⅰ散在分布于细胞质内，自噬发生时，LC3Ⅰ可被招募至自噬体膜上，酶解掉一小段多肽转变为LC3Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜，LC3Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被作为自噬体的标记。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值越大，表明自噬水平越高[25]。通过免疫荧光检测LC3 表达可初步确定TSPJ 能促进自噬发生。Beclin1是自噬相关基因Atg6的同源基因，定位于高尔基体，通过与PI3K形成复合物调控自噬小体的形成，在自噬早期阶段发挥启动作用，一般用Beclin1作为自噬启动阶段活化的标志分子，其表达升高可看作是自噬增强的标志[26]。另外由于自噬体的形成加速了自噬通量，有助于降解p62蛋白，p62是一种泛素结合蛋白，介导底物与LC3的结合，从而被选择性地转移到自噬体中进行降解。p62通常被看作自噬降解蛋白质底物的标志性分子[27]。自噬被诱导时，p62定位在自噬小体并被递送到自噬溶酶体降解；相反，如果抑制自噬，p62蛋白会积累在自噬小体。本研究Western blot结果表明，TSPJ能上调LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表达，下调p62蛋白表达，配合自噬抑制剂3-MA，说明TSPJ作用于BV2细胞能诱导自噬。

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在哺乳动物中包含Akt1、Akt2和Akt3 3种亚型，也是PI3K信号的下游分子。mTOR复合体（mTORC）2和其他潜在激酶可使Akt磷酸化。Akt的激活和稳定性受多层磷酸化的调控。激活的Akt可使大量底物磷酸化，在生理和病理上均能引起机体细胞功能改变，包括细胞存活、生长、代谢、肿瘤发生和转移。mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是多条信号通路的交汇点，通过对上下游信号的传导影响细胞自噬，是调控自噬的关键环节[28]。Akt/mTOR信号通路在调节炎症反应过程中起关键作用，是参与细胞生长和代谢的关键途径，有助于维持众多环境信号的正常运行。本研究结果显示，LPS刺激BV2细胞后，p-Akt、p-mTOR蛋白表达升高，TSPJ 能抑制p-Akt、p-mTOR 表达，与Akt通路抑制剂GSK690693合用时抑制效果增强。说明TSPJ可能通过抑制Akt/mTOR通路磷酸化促进BV2细胞自噬。

综上所述，TSPJ能抑制LPS诱导的BV2细胞炎症反应，调节炎症因子分泌，其机制与抑制Akt/mTOR信号通路磷酸化，促进细胞自噬有关。