竹节参皂苷类化合物HPLC指纹图谱研究

邹海艳 刘珊珊 李 佳 马 晗 赵 晖

（首都医科大学中医药学院，北京，100069）

竹节参皂苷类化合物HPLC指纹图谱研究

邹海艳 刘珊珊 李 佳 马 晗 赵 晖

（首都医科大学中医药学院，北京，100069）

目的：建立竹节参药材皂苷类成分HPLC指纹图谱的研究方法，为竹节参药材的质量控制提供依据。方法：采用Hibar C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈-0.1%的磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长203 nm，柱温30℃；测定了7批市售竹节参药材的HPLC指纹图谱。结果：竹节参的指纹图谱共检出12个共有峰，通过对照品比对指认了其中的7个共有皂苷类成分，7批药材中有6批相似度均达到0.9以上。结论：该方法精密度、稳定性、重复性好，特征性及专属性强，可用于竹节参药材的质量控制。

竹节参；皂苷类化合物；HPLC；指纹图谱

竹节参，又名竹节人参、竹节三七、白三七，是五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey的干燥呈竹鞭状的根茎。竹节参收载于1977年以后的各版《中华人民共和国药典》，具有滋补强壮，有散瘀止痛，止血祛痰的功效，常用于治疗病后虚弱，劳嗽咯血，咳嗽痰多，跌扑损伤等证［1-2］。竹节参中主要含有皂苷类化合物、多糖、挥发油、氨基酸等成分，现代药理研究表明，皂苷类化合物是竹节参中的主要有效成分，在中枢神经系统、消化系统、心血管系统、免疫系统等方面均有较好的活性［3-5］。竹节参中的皂苷类成分主要为齐墩果烷型和达玛烷型三萜皂苷，其中以齐墩果烷型皂苷含量为高，包括竹节参皂苷Ⅳa，Ⅴ，Ⅰb，Ⅳ等［5］。竹节参广泛分布于我国云南、四川、湖北、贵州等省，是民间常用中草药，但迄今为止，《中华人民共和国药典》尚未建立相应的质量控制标准，本文在前期化学成分研究的基础上，针对竹节参中的皂苷类化合物，进行了HPLC指纹图谱的研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent HP 1260高效液相色谱仪，配有自动进样器、柱温箱及DAD检测器；舒美双频数控超声波清洗器（KQ-500VDE，昆山市超声仪器有限公司），RT-04高速粉碎机，赛多利斯万分之一分析天平。

1.2 试剂 乙腈（Caledon，色谱纯），娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。人参皂苷Rb1（批号：110704～201122）、人参皂苷Rg1（批号：110703～201027）、人参皂苷Rd（批号：111818～2010001）、人参皂苷Re（批号：110754～200822）、竹节参皂苷IVa（批号：111861～201001），均为含量测定用，购于中国药品生物制品检定所；人参皂苷R0（批号：MUST-12010503，纯度＞98%，购于北京世纪奥科生物技术有限公司）；巨花雪胆皂苷B（自制）、Cynarasaponin C（自制）、竹节参皂苷IV（自制）。

1.3 药材 7批竹节参药材分别购于广西（S1）、四川（S2）、云南（S3）、陕西（S4，S5）、湖北（S6）、湖北恩施（S7）；由首都医科大学中医药学院李佳副教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hibar C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30 min，19%～19%A；30～35 min，19%～23%A；35～63 min，23%～32%A；63～85 min，32%～70%A）；流速1.0 mL·min-1，检测波长203 nm，柱温30℃，进样量10μL。

2.2 对照品溶液的制备 分别取人参皂苷Rg1、Re、R0、Rb1、Rd、竹节参皂苷Ⅳa、Ⅳ、cynarasaponin C、巨花雪胆皂苷B适量，用甲醇溶解制成混合对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 取竹节参药材，粉碎，过60目筛，取样品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇30倍量，称重，超声提取1 h，放至室温，补足失重，过滤，取续滤液用0.45μm滤膜滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取同一竹节参供试品溶液适量，连续进样6次，按上述色谱条件测定，以竹节参皂苷Ⅳa为参照物，测得各共有峰的相对保留时间RSD≤0.60%，相对峰面积RSD≤1.02%，符合指纹图谱研究技术要求。

2.4.2 重复性试验 取同一竹节参药材样品6份，按上述方法平行制备供试品液，并进行测定，以竹节参皂苷Ⅳa为参照物，测得各共有峰的相对保留时间RSD≤0.17%，相对峰面积RSD≤2.72%，符合相关要求。2.4.3 稳定性试验 取同一竹节参供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h进行测定，以竹节参皂苷Ⅳa为参照物，测得各共有峰的相对保留时间RSD≤0.60%，相对峰面积RSD≤2.18%，表明样品溶液20 h内稳定。

2.5 竹节参皂苷类成分指纹图谱的建立

2.5.1 共有峰的确定和化合物的指认 按2.1项下色谱条件，分别对7批竹节参药材样品进行HPLC分析，记录图谱（见图1），采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件进行数据处理，以平均数生成竹节参皂苷类成分的指纹图谱，经分析确定指纹图谱中有12个峰为共有特征峰，即1～12号峰（见图2）。采用混合对照品对照（见图3），指认了其中的7个共有峰，即2～4号、6号、10～12号共有峰分别为人参皂苷Rg1、Re、Rb1、R0、竹节参皂苷Ⅳ、人参皂苷Rd和竹节参皂苷Ⅳa，由图可知，6，9，10，12峰为主要的共有峰，峰面积平均值约为总峰面积的90.19%。

2.5.2 不同批次竹节参药材指纹图谱相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件对7批竹节参药材的指纹图谱进行分析，结果7批竹节参药材（S1～S7）相似度分别为0.999，0.986，0.966，0.997，0.958，0.959，0.702。除购于湖北恩施的样品外，其余批次药材的相似度均大于0.9，相似度良好。

图1 7个批次竹节参药材的HPLC指纹图谱

图2 竹节参药材HPLC指纹图谱

图3 混合对照品溶液的HPLC图谱

3 讨论

1）实验中对色谱条件进行了优化，分别比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水为流动相的分离效果，结果以乙腈-0.1%磷酸水为流动相时，基线漂移小，色谱峰峰形较好。试验还比较了203 nm，220 nm，254 nm，280 nm，320 nm，360 nm各检测波长下的色谱图，发现检测波长为203 nm时，色谱峰数目最多，响应值高，同时考虑到皂苷类成分主要为末端吸收，并参考相关文献［7］，故选择203 nm为检测波长。

2）实验中考察了供试品液的制备方法，以竹节参皂苷Ⅳa的峰面积为指标，分别对药材的提取方法（回流、浸渍、超声），提取溶剂（95%、70%、35%甲醇和乙醇），以及提取时间（30 min，1 h，2 h）进行了考察，结果显示，70%甲醇回流1 h和超声1 h效果接近，超声提取1 h和2 h无统计学意义，因此选择70%甲醇超声1 h进行提取。

3）近年来，竹节参药材需求量不断增涨，竹节参药材产地较多，市场上野生和家种药材并存，本实验曾收集了10个不同批次的竹节参药材，其中有3批样品外形与竹节参相似，但HPLC谱图中不含有上述特征峰，经显微鉴别发现这些批次药材粉末中无草酸钙簇晶，不属于人参属植物，应为伪品；7批竹节参药材检测结果表明，湖北恩施（S7）所产竹节参药材样品出峰较多，含有巨花雪胆皂苷B、cynarasaponin C等皂苷，其主要色谱峰的峰面积也与其他样品相差较大，相似度较低（0.702），可能与竹节参产地的生态环境、栽培年限、采收加工等因素有关［8-10］。以上结果说明市售的竹节参药材存在一定的质量差异和掺伪情况，因此，亟需建立相应的质量控制方法。

4）本实验建立了竹节参药材皂苷类成分的HPLC指纹图谱分析方法，并对其主要色谱峰进行了指认，结果表明竹节参药材中主要皂苷类成分在色谱图中分离度良好，方法的稳定性、重复性、精密度符合要求，特征性及专属性强，可用于竹节参药材的质量控制。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部［S］.北京：化学工业出版社，2010：129.

［2］林先明，谢玲玲，由金文，等.竹节参名称及基原考［J］.中药材，2007，30（6）：742-743.

［3］李春艳，张杰，李劲平，等.竹节参化学成分与药理活性研究进展［J］.中医药导报，2012，18（4）：68-70.

［4］欧阳丽娜，向大位，吴雪，等.竹节参化学成分及药理活性研究进展［J］.中草药，2010，41（6）：1023-1025.

［5］贺海波，许佳，王洪武，等.竹节参不同提取部位预处理对冠脉结扎诱导大鼠急性心肌缺血损伤的影响［J］.第三军医大学学报，2011，33（14）：1462-1466.

［6］吴兵，陈新，张长春，等.竹节参化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2012，24（8）：1051-1054.

［7］贾放，陈平，王如锋，等.竹节参药材不同部位皂苷成分的分析研究［J］.时珍国医国药，2012，23（7）：1682-1684.

［8］童学飞，尹文仲，陈科力.栽培和野生竹节参中人参皂苷含量比较［J］.时珍国医国药，2006，17（10）：1919-1920.

［9］李玉洲，何毓敏，孙志伟，等.不同栽培年限竹节参中主要成分含量的动态变化［J］.安徽农业科学，2011，39（33）：20411-20413.

［10］关乔，张海滨，毛帅，等.鄂西竹节参野生品与栽培品的比较研究［J］.中药材，2013，36（2）：171-175.

（2014-04-14收稿 责任编辑：曹柏）

Studies on the HPLC Fingerprints of Saponins in Rhizoma Panax Japonicus

Zou Haiyan，Liu Shanshan，Li Jia，Mahan，Zhao Hui
（School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective：To establish HPLC fingerprintmethod for quality control of saponins in Rhizoma Panax Japonicus.Methods：The HPLCmethod was conducted based on a Hibar C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column，with acetonitrile-0.1%orthophosphoric acid as mobile phase by gradientelution.The detection wavelength was at203 nm.The flow ratewas1.0mL·min-1and the column temperature was 30℃.Seven samples from different sourceswere analyzed by HPLC.Results：Twelvemainmarker peakswere selected in the standard fingerprintand 7 peaksof saponinswere identified.The similarity of6 sampleswas over 0.9.Conclusion：The precision，repeatability and stability of themethod were up to standard，and thismethod can be used for quality evaluation of Rhizoma Panax Japonicus.

Rhizoma Panax Japonicus；Saponins；HPLC；Fingerprint

R282

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.033

国家自然科学基金（编号：81403095）；北京市属高校青年拔尖人才培育项目（编号：CIT＆TCD201404175，CIT＆TCD201404184）；首都中医药护理专项（编号：12ZYH08）

邹海艳（1974—），女，副教授，博士，主要研究方向：中药质量控制，Tel：（010）83911671，E-mail：bwzhy＠sina.com

赵晖（1973—），女，副教授；硕士研究生导师；Tel：（010）83911633，E-mail：zhaohui8957＠sina.com