UPLC-Q/TOF-MS法同时测定竹节参及其总皂苷中13个指标成分

龙 健，周昌园，田 力,3，涂 星,3，胡雪黎,3，时嘉琪，刘 丹，聂 娟,3，刘可云，杨 宝,3*

1.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大学化学与环境工程学院(湖北 恩施 445000) 3.湖北民族大学 武陵山中药材检验检测中心(湖北 恩施 445000)

竹节参为五加科人参属植物竹节参PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根茎，收载于《土家族药物志》和2020版《中国药典》，是恩施地区的道地药材，药用功能类似三七和人参，甘、微苦，性温，归肝、脾、肺经，具有散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、补虚强壮的功效，常用于病后虚弱，劳嗽咯血，跌扑损伤等[1-2]。现代植物化学和药理学研究表明[3-7]竹节参富含三萜皂苷类和糖类成分，另含少量的氨基酸类和挥发油类成分，其中总皂苷部位具有较好的降血脂、降血糖、抗脂肪肝、减肥活性。

中药化学成分的复杂性和多样性是其发挥药效的基础，同时也是其质量评价与控制的难点，建立含量测定标准时应尽可能较为全面地反映其内在质量。2020版《中国药典》竹节参含量测定项下是以竹节参皂苷V和竹节参皂苷Ⅳa作为质控成分，这只是对其质量控制的最基本要求，尚不能较为全面地反映其化学成分的复杂性和多样性[2]。针对竹节参化学成分特点，且总皂苷是其主要活性部位，建立多皂苷类成分同时测定的方法更具有整体性和实用性。目前竹节参指标成分含量测定的方法主要有液相色谱法[2，8]、液相色谱-串联质谱法[9]。相比于上述方法，超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q/TOF-MS)的分辨率和灵敏度更高，在定量分析的同时还能够根据精确分子量确证。考虑到竹节参皂苷类成分的结构相似度较高，普通液相色谱分离较为困难，UPLC-Q/TOF-MS更加适合其定量分析。

本实验首先报道了一种快速制备竹节参总皂苷部位的方法，其总皂苷的含量高达84.1%。在此基础上建立了测定竹节参及其总皂苷部位中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rb2、拟人参皂苷RT1、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、人参皂苷Rd含量的UPLC-Q/TOF-MS方法，以期更加快速和全面地对其进行质量分析和控制。

1 仪器与材料

1.1仪器Acquity UPLC超高效液相色谱仪、Xevo G2-XS Q/TOF型质谱仪、UNIFI数据处理软件、Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，美国Waters公司；梅特勒ME204分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；TD5A-WS型离心机，湖南相仪实验仪器开发有限公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司。

1.2材料对照品20S-人参皂苷Rbl(批号MUST-20060101)、20S-人参皂苷Rd(批号MUST-20072210)均购于成都曼思特生物科技有限公司。对照品20S-人参皂苷Rb2(批号wkq21062404)、20S-人参皂苷Rb3(批号wkq21062405)、竹节参皂苷IV(批号wkq21052810)、20R-人参皂苷Rh1(批号wkq21090609)、20S-人参皂苷Rg2(批号111779-200801)均购于四川省维克奇生物科技有限公司。对照品竹节参皂苷V(批号111903-202106)、20S-人参皂苷Re(批号110754-202129)、20S-人参皂苷Rf(批号111719-201806)、20S-人参皂苷Rg1(批号110703-202034)、竹节参皂苷IVa(批号111861-201102)均购于中国食品药品检定研究院。对照品拟人参皂苷RT1(批号J24GB155864)购于上海源叶生物科技有限公司。质谱级乙腈、甲醇购自德国Merck公司；色谱级甲酸购自上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。9批次(S1～S9)竹节参药材采集于湖北省宣恩县，经湖北民族大学涂星讲师鉴定为五加科植物竹节参PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1竹节参乙醇提取物及总皂苷的制备竹节参干燥药材2.8 kg(同含量测定实验S3批次)，粉碎成粗粉后用乙醇(37 L)渗滤提取，提取液浓缩干燥后即得605 g乙醇提取物(TQ)。取417 g乙醇提取物经大孔树脂分离，依次用蒸馏水(25 L)、20%乙醇-水(25 L)、80%乙醇-水(30 L)和95%乙醇-水(25 L)洗脱，回收80%乙醇-水部分洗脱液即得222 g竹节参总皂苷(TS)，测得竹节参乙醇提取物和总皂苷部位中总皂苷的含量分别为49.2%和84.1%。

2.2供试品溶液的制备取9批次竹节参药材及“2.1”项下竹节参乙醇提取物和总皂苷部位粉末约0.2 g，加60%甲醇25 mL，密塞，称量，室温下超声处理40 min，冷却至室温，再称量，用60%甲醇补足差量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过。取0.5 mL竹节参药材滤液，用60%甲醇分别稀释40倍和1 000倍作为供试品溶液；取0.5 mL竹节参乙醇提取物滤液，用60%甲醇分别稀释80倍和2 000倍作为供试品溶液；取0.5 mL竹节参总皂苷部位滤液，用60%甲醇分别稀释125倍和4 000倍作为供试品溶液。

2.3对照品溶液的制备分别精密称取人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rb2、拟人参皂苷RT1、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、人参皂苷Rd对照品适量，用色谱甲醇配置成质量浓度为1.29、1.25、0.69、1.06、0.95、1.21、1.01、0.78、1.03、1.03、1.05、0.95、1.05 mg/mL的单一对照品储备液。精密吸取上述单一对照品储备液适量，用甲醇配制成质量浓度依次为1 000、1 000、1 000、1 000、1 000、1 000、2 500、1 000、1 000、1 000、1 250、2 500、500 ng/mL的混合对照品储备液。

2.4色谱质谱条件

2.4.1 色谱条件 Waters UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脱，0～3.0 min，15%～25%A；3.0～5.0 min，25%～29%A；5.0～11.0 min，29%～35%A;11.0～15.0 min，35%～75%A。流速0.4 mL/min，进样量1.5 μL，柱温40℃。

2.4.2 质谱条件 Waters Xevo G2 Q-Tof质谱仪，ESI负离子模式采集数据，毛细管电压-2.5 kV，锥孔电压-40 V，脱溶剂气温度550℃，脱溶剂气流量900 L/h，扫描范围m/z 400～1 200，用亮氨酸脑啡肽实时校正质量轴，采用一级质谱定量，具体定量参数见表1。13个成分在混合对照品和样品中的定量离子色谱图见图1，结果表明样品测定无明显干扰，该方法专属性良好。

表1 13个成分的质谱参数

2.5方法学考察

2.5.1 线性关系考察 取“2.3”项下混合对照品储备液，用色谱甲醇稀释为系列质量浓度的标准曲线工作液，按上述色谱质谱条件进样分析，记录峰面积。以峰面积(Y)对待测物浓度(X)做线性回归，得到回归方程和相关系数，并以S/N=10计算定量下限(LOQ)，见表2。

表2 回归方程、相关系数、线性范围

2.5.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液，按上述色谱质谱条件连续进样6次，记录峰面积。人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rb2、拟人参皂苷RT1、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、人参皂苷Rd峰面积的RSD分别为1.07%、1.52%、0.99%、1.12%、0.91%、1.71%、0.99%、1.08%、1.68%、1.45%、1.20%、1.39%、1.65%，表明仪器的精密度良好。

注：1：人参皂苷Re；2：人参皂苷Rd；3：人参皂苷Rg1；4：人参皂苷Rf；5：人参皂苷Rg2；6：人参皂苷Rh1；7：人参皂苷Rb1；8：竹节参皂苷V；9：人参皂苷Rb2；10：人参皂苷Rb3；11：拟人参皂苷RT1；12：竹节参皂苷IV；13：竹节参皂苷IVa；A：对照品；B：样品。图1 化合物1-13的提取离子流图(负离子模式)

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液(S3)，按上述色谱质谱条件分别在0、2、4、8、12、24、48 h进样，记录峰面积。人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rb2、拟人参皂苷RT1、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、人参皂苷Rd峰面积的RSD分别为1.32%、1.92%、1.37%、1.11%、1.37%、1.75%、0.98%、1.81%、1.75%、1.68%、1.39%、1.73%、1.77%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 精密称取同一批样品(S3)6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4”项下色谱和质谱条件进样分析，结果显示样品中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rb2、拟人参皂苷RT1、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、人参皂苷Rd的平均含量分别为5.54、4.19、0.90、0.19、0.04、2.01、88.12、0.04、1.42、0.12、52.77、8.60、0.53 mg/g。RSD分别为1.68%、1.71%、1.02%、1.76%、1.14%、1.98%、0.75%、1.55%、1.46%、0.49%、1.51%、1.78%、0.77%，表明方法的重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批次竹节参样品(S3)6份，0.1 g，精密加入13个成分的对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4”项下色谱和质谱条件进样分析，记录峰面积。结果人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rb2、拟人参皂苷RT1、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、人参皂苷Rd的平均加样回收率分别为98.96%、98.45%、99.33%、97.57%、100.86%、100.45%、99.83%、99.22%、97.50%、100.29%、99.24%、100.05%、97.27%，RSD分别为2.68%、1.95%、2.15%、1.86%、2.25%、1.88%、2.79%、2.46%、2.01%、2.99%、0.91%、1.08%、1.21%，表明该方法准确度良好。

2.5.6 样品含量测定 称取9批竹节参药材、1批次竹节参乙醇提取物、1批次竹节参总皂苷，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析，通过回归方程计算含量，见表3。9批竹节参药材中13个成分含量的热图见图2。

表3 样品含量测定结果(n=3,mg/g)

图2 9批次竹节参药材中13种成分含量热图

3 讨论

3.1指标成分的选择三萜皂苷类是竹节参中的主要成分，具有较好的降血脂、降血糖、抗脂肪肝活性。目前从竹节参中已分离鉴定了110多个三萜皂苷类成分，多数是以齐墩果酸、人参二醇、人参三醇为基本母核，连接一至数个配糖基形成的苷类[3]。课题组采用UPLC-Q/TOF-MSe技术结合UNIFI分析平台对竹节参的化学成分进行了全面分析，结果表明人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、竹节参皂苷V、人参皂苷Rb2、拟人参皂苷RT1、人参皂苷Rb3、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、人参皂苷Rd在各批次样本中的含量较高，且无明显干扰。药理学研究表明[4，10-11]竹节参皂苷Ⅴ、拟人参皂苷RT1、竹节参皂苷Ⅳ、竹节参皂苷Ⅳa、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re等均具有较好的生物活性。因此，本研究选择以上13种成分作为竹节参药材多成分含量测定的指标成分。

3.2色谱及质谱条件优化本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时对样品中各色谱峰形及分离度的影响，特别是针对竹节参中多对同时存在的R和S构型人参皂苷类成分，结果表明乙腈-0.1%甲酸水作为流动相梯度洗脱时，可在较短时间内分离各化合物。13个指标成分在ESI源负离子检测模式下的响应明显高于正离子模式，主要形成[M-H]-准分子离子峰和[M+HCOO]-加合离子峰，在上述色谱和质谱条件下[M+HCOO]-加合离子峰的响应更高且信号较为稳定。因此，本实验选择了[M+HCOO]-加合离子峰作为定量离子。

3.3指标成分的含量分析如表3和图2所示，13种成分在9批次竹节参药材中的含量范围依次为0.70～7.71、0.77～10.77、0.07～1.23、0.06～1.08、0.01～2.97、0.75～5.04、43.99～95.06、0.02～0.08、0.49～27.86、0.05～0.22、18.74～61.40、2.40～30.83、0.03～1.74 mg/g，除竹节参皂苷V(人参皂苷Ro)、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa外，其余10种成分的含量相对较低。不同批次间13个指标成分含量差异较大，可能与种质资源、种植环境、种植方式和生长年限有关。2020年版《中国药典》规定竹节参中含竹节参皂苷V和竹节参皂苷Ⅳa分别不得低于15.0 mg/g，本研究中仅S5批次两种指标成分的含量符合规定，合格率仅为11.1%。其余8批次仅竹节参皂苷V的含量符合标准(远高于15.0 mg/g)，竹节参皂苷Ⅳa的含量均未达标，这与其他单位检测宣恩产竹节参的结论基本一致。

竹节参主要生长于高海拔地区，目前野生资源储量不多[3,12]。为了满足药用需求，研究人员对竹节参野生品种进行低海拔山区驯养或转家养，生长环境的改变以及种质资源的优劣不可避免地会影响竹节参皂苷Ⅳa的含量。宣恩地区为提高竹节参的品质，应该优化其种质、种植环境、田间管理以及采收时间。另外，竹节参皂苷IV在9批次药材中的含量较高，平均含量为42.22 mg/mg，且竹节参皂苷IV的药理活性也较好[4,10]，因此在后期《中国药典》竹节参含量测定标准修订时，应考虑纳入竹节参皂苷IV作为质控成分。

本研究还报道了一种快速制备竹节参总皂苷的方法，即采用乙醇渗滤提取，大孔树脂一步法快速富集。结果竹节参总皂苷中竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa的含量依次为363.14、238.25、51.56 mg/g，13种指标性成分的总含量为773.95mg/g(占比84.36%)，富集效果非常明显，可以用于后续的药效学研究。

综上所述，本研究报道了一种快速制备竹节参总皂苷部位的方法，总皂苷部位中总皂苷的含量高达84.1%，富集效果明显。本实验基于UPLC-Q/TOF-MS建立了一种同时测定竹节参药材和总皂苷部位中13种指标成分含量的方法，该方法简单快速，精密度、重复性、稳定性良好，可用于竹节参药材和总皂苷的质量评价，以及为《中国药典》竹节参质量标准地提升提供参考依据。