固本防哮饮对哮喘缓解期小鼠肺组织线粒体凋亡相关因子CytC、Bcl-2及Caspase-3表达的影响

姜越，赵霞，严花

南京中医药大学附属医院，江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，江苏 南京 210029

支气管哮喘是一类由多种炎症细胞参与的慢性呼吸道炎症性疾病，表现为可逆的呼气性气流受限，进一步发展可出现不可逆性气道狭窄和气道重塑[1]。近年来，哮喘发病率与病死率呈逐年增长趋势[2]。尽管大部分哮喘患者对西医常规治疗反应较好，但仍存在一部分对类固醇治疗反应欠佳的患者，有效防治哮喘的手段有待补充。中医学注重病证结合，兼顾疾病所处阶段及证型，采用更具针对性的治疗方法，在哮喘防治中有独特优势[3]。

固本防哮饮是中医儿科专家江育仁教授的经验方，具有补肺固表、健脾化痰功效。临床研究显示，该方治疗儿童哮喘缓解期安全有效[4]。课题组前期研究发现，固本防哮饮防治哮喘可能与调控内质网应激介导的细胞凋亡、减轻慢性气道炎症有关[5]。细胞异常凋亡会诱发和加重哮喘，其中线粒体损伤诱发的细胞凋亡是不可逆的，也是细胞凋亡效应产生的“导火索”[6-7]。本实验观察固本防哮饮对哮喘缓解期小鼠肺组织线粒体凋亡相关启动因子细胞色素C（CytC）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达的影响，探讨其防治哮喘气道重塑的潜在作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级Balb/c小鼠36只，体质量16～18 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于南京中医药大学实验动物中心，温度20～22 ℃，湿度50%～70%，12 h光暗循环，自由进食饮水。本实验经南京中医药大学动物伦理委员会审批（202012A054）。

1.2 药物

固本防哮饮由炙黄芪 15 g、党参10 g、白术10 g、茯苓10 g、煅牡蛎15 g、蝉蜕10 g、陈皮6 g、防风6 g、辛夷6 g、五味子6 g、甘草3 g组成。饮片购于南京中医药大学附属医院，经常规煎煮、浓缩后，制成含原药材3.6 g/mL溶液，4 ℃冰箱保存备用。孟鲁司特钠片，10 mg/片，杭州默沙东药业股份有限公司，批号K004567。将药片粉碎，用蒸馏水溶解，配制成0.26 mg/mL溶液。

1.3 主要试剂及仪器

呼吸道合胞病毒（RSV）long株病毒，冻存于江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室-80 ℃冰箱备用；卵蛋白（OVA，批号326A058），美国Sigma 公司；小鼠白细胞介素（IL）-17A ELISA试剂盒（批号E-EL-M0047c）、神经生长因子（NGF）ELISA试剂盒（批号E-EL-M0815c），武汉伊莱瑞特；兔抗小鼠Bcl-2抗体（批号26593-1-AP）、兔抗小鼠Caspase-3 抗体（批号19677-1-AP），美国Proteintech公司；山羊抗兔多克隆二抗（批号ab6721），英国Abcam公司；β-actin抗体（批号YM1206）、BCA 蛋白定量试剂盒（批号23227）、DEPC水（批号R0021）、总RNA提取试剂盒（批号9109）、反转录试剂盒（批号RR306A）、qPCR定量试剂盒（批号RR820A），加拿大ABM公司。化学发光成像仪（型号Chemi-Doc），美国Bio-Rad 公司；Western blot电泳仪（型号BioPhotometer），美国Bio-Rad公司；Semi-dry transfer半干转膜仪（型号TE77），美国GE 公司； 蛋白核酸分析仪（ 型号BioPhotometer）、PCR 自动化系列化分析仪（型号AG22332），德国Eppendorf 公司；荧光定量PCR 仪（型号QuantStudio7 Flex），美国Life technologies公司。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

小鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法分为正常组、模型组、孟鲁司特钠组及固本防哮饮低、中、高剂量组，每组6只。参照课题组前期方法[8]制备哮喘缓解期小鼠模型：第1、8 日予0.2 mL 致敏液（OVA 100 μg、氢氧化铝1 mg溶于生理盐水）腹腔注射致敏，第15 日开始雾化吸入2.5%OVA 雾化剂激发30 min，1 次/d，连续14 d；第32～54日将雾化频次改为3 d激发1 次，每次30 min，共8 次。第29、42、55 日予RSV 50 μL/只滴鼻诱导激发。以小鼠肺组织有炎症浸润及气道胶原沉积表现认定造模成功。

第56日起，孟鲁司特钠组按2.6 mg/kg灌胃孟鲁司特钠溶液，固本防哮饮低、中、高剂量组分别按12、24、36 g/kg灌胃固本防哮饮溶液，正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水，连续30 d。末次给药后24 h，麻醉小鼠，脱颈处死，取肺组织放于液氮中，置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 Masson染色观察肺组织气道胶原纤维沉积

肺组织经多聚甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片，切片常规脱蜡至水，滴加Masson复合染色液染色5 min，蒸馏水冲洗，滴加磷钼酸染色5 min，甩干，滴加苯胺蓝染色液染色5 min，蒸馏水冲洗3 s，分化液分化30～60 s，重复2次，无水乙醇脱水3次，每次2 min，二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性树胶封固，显微镜下观察。

2.3 qPCR检测

按照总RNA提取试剂盒步骤提取肺组织RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度。参照反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，根据说明书进行PCR，采用SYBR Green Master Mix选取20 μL反应体系。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30～34 s，共40 个循环。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.4 免疫组化染色

石蜡切片脱蜡水化，抗原修复，使用3%H2O2室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS洗涤后封闭，室温孵育1 h，蒸馏水洗涤，滴加CytC一抗（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，滴加二抗，室温孵育1 h，洗涤后DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水，封片，显微镜下观察，阳性表达呈黄色或棕色颗粒。随机选择3个不同视野，Image J软件统计阳性染色面积。

2.5 Western blot检测

称取10～15 mg肺组织，分别加入裂解液300 μL，研磨使充分裂解，4 ℃、13 000 r/min离心30 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，将上样蛋白浓度定为2 μg/μL。用10%分离胶电泳，转膜后置于5%脱脂奶粉中封闭1 h，加入CytC一抗（1∶200）、Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加二抗，室温孵育1 h，ECL发光液曝光成像。用Image J软件进行灰度分析，以目的蛋白灰度值与内参灰度值比值计算目的蛋白相对表达量。

2.6 ELISA检测肺组织白细胞介素-17A、神经生长因子含量

称取10～15 mg 肺组织，按1∶9（W/V）加入PBS，使用研磨仪充分研磨，4 ℃、15 000×g离心10 min，取上清液，BCA试剂盒检测蛋白浓度，将浓度定为3 μg/μL，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测肺组织匀浆IL-17A、NGF含量。

3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 固本防哮饮对模型小鼠肺组织气道胶原沉积的影响

Masson染色中胶原纤维呈蓝色。与正常组比较，模型组小鼠肺组织气道中大量胶原纤维沉积，附着于气道壁周围，气道壁增厚；固本防哮饮各剂量组及孟鲁司特钠组小鼠肺组织气道中胶原纤维沉积较模型组减少，气道壁变薄，炎性浸润减轻。见图1。

图1 各组小鼠肺组织形态（Masson染色，×400）

4.2 固本防哮饮对模型小鼠肺组织细胞色素C、B细胞淋巴瘤-2、半胱氨酸蛋白酶-3 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠肺组织CytC mRNA表达显著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，固本防哮饮各剂量组及孟鲁司特钠组CytC mRNA表达显著降低（P＜0.01），固本防哮饮各剂量组Bcl-2 mRNA 表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01），固本防哮饮高剂量组Caspase3 mRNA表达显著降低（P＜0.05）；孟鲁司特钠组和固本防哮饮各剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肺组织CytC、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达比较（±s）

表2 各组小鼠肺组织CytC、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.3 固本防哮饮对模型小鼠肺组细胞色素C 表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠肺组织CytC表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，固本防哮饮各剂量组及孟鲁司特钠组CytC表达不同程度降低，以固本防哮饮低、中剂量组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见图2、表3。

图2 各组小鼠肺组织CytC阳性表达（免疫组化染色，×200）

表3 各组小鼠肺组织CytC阳性表达比较（±s，阳性染色面积）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.4 固本防哮饮对模型小鼠肺组织细胞色素C、B细胞淋巴瘤-2、半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠肺组织CytC 和Caspase-3蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，固本防哮饮低剂量组CytC蛋白表达显著降低（P＜0.05），固本防哮饮各剂量组Bcl-2蛋白表达显著升高（P＜0.05），固本防哮饮低、中剂量组和孟鲁司特钠组Caspase-3蛋白表达显著降低（P＜0.01）；孟鲁司特钠组和固本防哮饮各剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表4。

图3 各组小鼠肺组织CytC、Bcl-2、Caspase-3蛋白免疫印迹

表4 肺组织CytC、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

表4 肺组织CytC、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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4.5 固本防哮饮对模型小鼠肺组织白细胞介素-17A、神经生长因子含量的影响

与正常组比较，模型组小鼠肺组织IL-17A、NGF含量显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，固本防哮饮低剂量组IL-17A含量显著减少（P＜0.05），固本防哮饮各剂量组和孟鲁司特钠组NGF含量显著减少（P＜0.05，P＜0.01）；孟鲁司特钠组和固本防哮饮各剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 各组小鼠肺组织IL-17A、NGF含量比较（±s）

表5 各组小鼠肺组织IL-17A、NGF含量比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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5 讨论

支气管哮喘属中医学“哮病”“喘证”范畴，病位在肺，关联脾肾两脏，甚则累及于心。其反复发作，迁延不愈，致肺阴耗伤、脾阳受损、肾之阴阳亏虚，进一步加重肺、脾、肾三脏损耗。支气管哮喘缓解期主要病机为虚、痰、瘀，痰饮内伏于肺，肺虚行气无力，脾虚运化失常，聚湿成痰，痰瘀互结，治疗当以补益脏腑之气，兼舒畅气机为主[9]。固本防哮饮以扶正固本思想为依据，方中炙黄芪为君药，益肺固表止汗；陈皮、党参、白术、茯苓为臣，助黄芪培土生金，益气健脾、燥湿化痰；防风、蝉蜕、辛夷为佐，疏风解表、宣通鼻窍，五味子同为佐药，敛肺止咳，助黄芪固表敛汗；煅牡蛎、甘草为使，调和方中诸药，协助黄芪敛阴潜阳、固涩止汗。全方药性平和，疏补适宜，散收有度，攻补兼施，共奏补肺固表、健脾化痰之功。临床及基础研究显示，固本防哮饮可有效减少哮喘缓解期慢性气道炎症和气道胶原沉积，缓解气道重塑[10-13]。

气道重塑是哮喘反复发作、迁延不愈的重要因素。因此在哮喘缓解期除重视减缓气道慢性炎症，还应加强对气道重塑的防治。有学者认为，气道重塑涉及气道上皮细胞、气道平滑肌细胞等多种细胞功能变化[14]，支气管上皮细胞是保护气道免受致病因子侵袭的物理屏障，其反复损伤-修复会直接诱导哮喘慢性气道炎症和气道重塑发生[15]。细胞凋亡是机体主动接受基因调控，排除自身无用及多余细胞，适应有利生存条件，恢复内环境稳态的自主性有序死亡，又称细胞程序性死亡。细胞凋亡参与和调控各类气道细胞增殖与分化、诱导炎症因子及趋化因子释放等[16-17]，在气道重塑中发挥重要作用。哮喘病程中存在支气管上皮细胞凋亡表现[18]，线粒体介导的凋亡途径是调控细胞凋亡的中心环节[19-20]，Caspase-3和Bcl-2表达失衡是导致细胞凋亡机制改变、启动线粒体凋亡通路，诱导哮喘气道重塑的重要原因之一[21]。Caspase-3为促凋亡基因，能反映支气管上皮细胞凋亡情况，是Caspase家族重要的蛋白酶，被激活后产生活性，参与水解和切割多种细胞结构蛋白，完成细胞凋亡的实施[22-23]。Bcl-2有抑制凋亡作用，主要通过切断细胞凋亡信号通路，抑制CytC释放，阻断下游Caspase级联反应激活途径，使其丢失引起细胞凋亡的必要条件[24-25]；Caspase-3能够切割Bcl-2，将其分解成分子量较小的片段，这些片段具有促凋亡作用[26]。因此，上调Bcl-2、减少CytC释放和Caspase-3激活可能是抑制细胞凋亡，维持细胞稳态，预防细胞过度增殖，减缓哮喘气道重塑的重要环节。

基底膜增厚是气道重塑的重要指征，哮喘缓解期基底膜出现增厚[12]。IL-17A 和NGF 具有促进气道炎症、气道高反应性，诱发气道重塑作用[27-29]。本研究Masson染色发现，模型组小鼠肺组织气道中大量胶原纤维沉积，气道壁增厚，肺组织IL-17A、NGF含量升高，提示存在气道结构改变和气道重塑表现，符合哮喘缓解期特征；同时肺组织Bcl-2蛋白和mRNA表达降低，CytC、Caspase-3 蛋白及CytC mRNA 表达升高，表明模型组小鼠气道内出现细胞凋亡异常情况，提示哮喘气道重塑的发生可能与细胞过度凋亡相关。固本防哮饮干预可改善模型小鼠气道胶原纤维沉积，抑制IL-17A、NGF 释放，下调CytC 和Caspase-3 蛋白及mRNA表达，上调Bcl-2蛋白及mRNA表达，提示固本防哮饮可能通过抑制气道上皮细胞凋亡，减轻气道重塑，防治哮喘。

综上，固本防哮饮可能通过调控线粒体凋亡通路，抑制气道上皮细胞过度凋亡，修复受损屏障，减轻气道重塑，发挥防治哮喘作用。本实验未深入研究线粒体凋亡途径在哮喘生理病理过程中扮演的具体角色，未研究细胞凋亡与上皮细胞、平滑肌细胞等的相互关系，需后续研究进一步完善。