HMGB1-TLR4信号通路及其调控物在抗肝纤维化中的应用价值

曾华华,马敏,孙宇杰,胡嘉敏,黄德斌

(湖北民族大学医学部,湖北 恩施 445000)

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是指致病因子致肝内持续慢性损伤与修复而导致的肝内结缔组织异常增生。HF主要是由于细胞外基质(ECM)在肝脏中的合成、分解失衡,是肝硬化和肝癌的前期病理过程[1]。由于HF的病理生理机制涉及多信号通路及相关细胞因子,如与TGFβ/Smad2/3Wnt、Notch、MAPK、PDGF等多种信号通路及TGFβ1、Dishavelled蛋白(Dsh)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等多种细胞因子调节有关。尤其是急、慢性炎症引起肝星状细胞(HSCs)活化而释放相关细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)等激活NF-κB等相应信号通路[2-3]。其中以白介素类和TNF-α为代表的前期炎症因子的研究较为深入,后期炎症因子在HSCs活化过程中的作用则鲜有报道。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是作用持久的晚期致炎因子之一,因此以HMGB1为靶点阻止HF较阻止其他早期炎症因子有着更为广泛的探索价值[4]。故本文就HMGB1-TLR4通路及其调控物在抗肝纤维化中的应用价值予以探讨。

1 HMGB1-TLR4通路的结构、相关因子与功能

1.1 HMGB1-TLR4信号通路的结构 HMGB1-TLR4信号通路家族主要包括受体HMGB1、配体TLR4、促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子NF-κB等。HMGB1是一种位于细胞核中的非组蛋白,由A-box、B-box、C-tail三个结构域组成,其A-box、B-box的长度约为75～80个氨基酸,由两条短和一条长的a螺旋组成,折叠后产生L形或V形的三维结构域结构。TLR4属于富含亮氨酸的受体家族,它们由N端胞外域(ECD)、跨膜域和C端胞内信号域组成,胞内区与IL-1受体胞内段有很高的同源性,故又称Toll-白细胞介素1受体(TIR)结构域,跨膜区是富含半胱氨酸的区域[5]。MAPK是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,其级联途径包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPKKK或MAP3K或MEKK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK或MAP2K或MKK或MEK)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK或MPK)三组成员[6];典型的MAPK级联反应途径由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成;其中MAPKKKK可分为Gck、Mst、Tao、Sok、PAK- related、Ste/PAK等8个亚族;MAPKKK分成MEKK亚族、Raf亚族和ZIK亚族;MAPK由ERK、p38、 JNK、ERK5四个亚族[5]。NF-κB是一个转录因子蛋白家族,包括Rel(cRel)、p65(RelA,NF-κB3)、RelB、p50(NF-κB1)和p52(NF-κB2)5个亚单位,其中p65、cRel和RelB分别含有N端Rel同源区(RHD)和C端的反式激活结构域(TD),在RHD的末端有一个核定位区域(NLS),p50和p52 只有RHD而缺乏TD。最常见的NF-κB是由p50和p65两个亚单位以不同形式组合成的同源或异源二聚体,NF-κB的结构包括DNA结合区域、蛋白质二聚化区和核定位信号[5]。

1.2 HMGB1-TLR4信号通路及相关因子与功能 HMGB1与TLR4结合后,调控下游依赖性和非依赖性MyD88信号通路[4]。由于HF主要与依赖性MyD88通路相关,其通过激活IκB激酶(IKK)导致核因子NF-κB的激活,从而释放TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β等促炎细胞因子及其他免疫相关基因、趋化因子(如干扰素γ)、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)等[6]。因此,在肝脏中,MyD88通路还促进HMGB1诱导的TNF-α因子的激活,形成一个正负反馈调节,从而形成互相影响的循环性传导模式。其具体环节如下。

1.2.1 NF-κB的调节作用 现已证实,核因子NF-κB在MyD88依赖性途径中,可以通过泛素化降解人肝癌细胞中IκBα激酶来抑制NF-κB的活性[7],同时它也通过依靠此途径阻断NF-κB的激活而阻止HF的损害[8]。也就是说,当肝脏受损后,NF-κB可通过调控免疫功能、炎症相关因子、生长因子、细胞增殖、凋亡等而发挥作用。这种作用主要是激活了肝脏中巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6等。其中TNF-a是炎症反应过程中出现最早的炎性介质,能激活中性粒细胞和淋巴细胞,使血管内皮细胞通透性增加,调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。IL-6能诱导B细胞转化为浆细胞形成抗体,并诱导T细胞活化增殖、分化,参与机体的免疫应答,是炎性反应中最重要的促发剂。IL-1β家族细胞因子通过IL-1β受体触发先天炎症,在先天免疫中占主导地位,但IL-1β家族也可以在获得性免疫中发挥作用[6]。炎症细胞因子促进HSCs的活化、增殖,使肝细胞的损伤及炎症反应加重,从而促进HF的发生与发展。显然,通过抑制这些促炎细胞因子可以减缓HF。

1.2.2 MAPK的激活作用 p38 MAPK是信号转导的重要介质,其中最丰富的家族成员是p38α,它有助于偶联细胞增殖和生长以响应某些破坏性刺激。活性氧(ROS)在细胞因子诱导的p38α活化中起关键作用。在生理条件下,p38α可以作为ROS信号传导的介质,细胞增殖、p38 MAPK活化和ROS产生之间的相互作用在肝细胞中起着重要作用[9]。因此,MAPK在HMGB1-TLR4信号通路中,通过抑制p38 MAPK的磷酸化来降低p38 MAPK的表达,从而对HF进展起抑制作用[10]。

2 HMGB1-TLR4在HF中的调控作用

随着各类研究的不断深入,HMGB1-TLR4信号通路在炎症反应中介导机制逐渐明朗,其信号轴与HF的关联愈加清晰。

2.1 HMGB1-TLR4通过影响HSC而加重HF 血清HMGB1是一种非侵入性、可重复且方便区分的标志物,其水平与HF关系密切[11]。Kao等[12]发现,HMGB1可上调平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)表达,抑制HSC中金属蛋白酶2(MMP-2)的活性而减少胶原蛋白的降解,并促进HSCs的增殖,有促HF作用。Ge等[13]研究证实,HF大鼠模型的肝组织中HMGB1表达明显上调,且其表达与胶原沉积密切相关。研究还证实,小干扰RNA(siRNA)能通过抑制HMGB1的表达而抑制HSCs转染过程中α-SMA和胶原蛋白的合成[13]。现有研究表明,HMGB1可以激活肝细胞中的TLR4信号通路,建立HMGB1自我维持回路。Yin等[14]发现,在小鼠HF模型中,TLR4通过DAMPs识别HMGB1,激活HSC,促进TNF-α和IL-1β等促炎因子的产生以及肝脏胶原蛋白的沉积,加重HF模型小鼠的肝脏损伤及炎症反应。

2.2 HMGB1-TLR4通过影响NF-κB促进炎症因子释放加重HF Liu等[15]发现在HMGB1/TLR4/NF-κB通路中通过抑制HMGB1在大鼠肝脏中的细胞质易位,减弱了核因子NF-κB、p65的核易位,并抑制了HF大鼠p-IκBα的肝脏表达,从而减轻肝损伤炎症反应。Yin等[14]在研究中证实了降低NF-κB和IκB蛋白的表达,从而可以抑制白细胞介素(IL)-1β、IL-6和TNF-α的产生,这进一步说明了影响NF-κB可以抑制炎症级联反应的作用。三草颗粒(SCG)抑制猪血清腹腔诱导HF,主要表现在延缓ALT、AST等HF血清标志物的水平升高和胶原沉积,这些变化都依赖于HMGB1-TLR4信号通路的激活[16]。这很可能是因为HSC中的HMGB1结合到TLR4后,受体构象改变并将信号传递给IKK激酶,进而使IκB蛋白磷酸化并将其从三聚体中解离出来。随后NF-κB二聚体暴露出核定位序列,迅速从细胞质进入细胞核内,与核内DNA上的特异序列相结合,促进相关基因的转录。这一实验提示影响NF-κB可能是临床靶向治疗HF的一种重要治疗手段。

2.3 HMGB1-TLR4通过激活MAPK加重HF 有研究证实,HMGB1可以通过蛋白激酶(ERK)/c-Jun N端激酶(JNK)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和抑制哺乳动物雷帕霉素(mTOR)/STAT3信号通路靶标诱导HSCs自噬[17]、抑制肝星状细胞的活化和增殖来减少HF[18]。Yoon等[19]发现可以通过阻断ASK1/MAPK途径来抑制HSC增殖和细胞外基质成分等纤维化反应。Lei等[20]通过抑制肝组织中p38-MAPK的磷酸化可以降低鞘氨醇激酶1(SPHK1)重组蛋白的产生,为从该方向治疗HF提供了可能性。HF大鼠的p-p38 MAPK的表达水平升高,使用p38 MAPK抑制剂SB203580抑制p38 MAPK信号通路后发现,HF相关指标表达水平降低,提示p38 MAPK信号通路与肝纤维化关系密切,且重点是抗肝纤维化作用可能通过p38 MAPK信号通路实现[21]。因此,HMGB1-TLR4可能作为临床抗纤维化药物治疗的潜在靶点,对于阻断肝硬化、肝癌的进展有重要意义。通过寻找针对HMGB1、TLR4、NF-κB、MAPK及相关炎症因子的拮抗剂可以为临床治疗HF并改善其预后提供新的途径。

3 HMGB1-TLR4调控物在抗HF中的应用价值

3.1 HMGB1-TLR4西药调控物在抗HF中的应用价值 HMGB1-TLR4信号通路可通过多条路径促进或抑制HF,因此其调控方式与调控物也较为多元化。其典型的代表物有TLR4、TNF-α和HMGB1抗体以及NF-κB抑制剂(吡咯烷二硫代氨基甲酸酯,PDTC)四类。当HMGB1与TLR4形成复合体后激活NF-κB。有研究证实,人源抗TLR4抗体IgG2能通过抑制炎症因子的表达、降低凋亡抑制蛋白的表达及细胞凋亡而减轻对乙酰氨基酚(APAP)诱导的小鼠肝损伤[22]。有学者证实,人类抗TLR4Fab片段(hTLR4-Fab0)可以特异性结合TLR4,降低脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的人巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎症因子水平,使其促炎作用明显减弱[23]。表明凋亡抑制蛋白和TLR4阻断剂可以成为治疗HF的新策略。由于NF-κB分泌炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6,因此应用PDTC自然可阻断TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌。有研究表明,PDTC对NF-κB的抑制作用可以防止基质金属蛋白酶(MMP)上调,使细胞中的ECM能够被金属蛋白酶抑制剂(TIMP)正常降解。而且PDTC治疗可以引起高血压大鼠模型明显的心脏纤维化以及增加间质胶原面积、心脏活性氧水平、明胶酶活性和MMP-2的表达[24]。此外,因HF和TNF-α抗体关系密切,TNF-α可以激活NF-κB,因此可以应用TNF-α抗体对该激活路径进行阻断延缓HF。还有研究证实,抗趋化因子受体CXCL16能显著抑制炎症巨噬细胞向肝脏浸润,降低肝内炎症细胞因子TNF的水平,显著减少高脂饮食后的脂肪肝变性[25]。表明靶向阻断CXCL16受体可能代表一种作为阻断与TNF-α信号传导有关的肝脏炎症反应的新方法。在HMGB1-TLR4中HMGB1可以通过趋化和触动机制促进HSCs增殖,因此,阻断HMGB1的位移显得至关重要,其通路激活剂可由抗HMGB1抗体阻断。研究证实,丁酸钠、异绿原酸A、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙酮酸乙酯等均可以作用于HMGB1,阻断它从细胞核移入细胞质,从而减轻HF[26]。表明抗HMGB1抗体可通过影响趋化和触动机制而抑制HSCs增殖减轻HF。因此,HMGB1-TLR4信号通路的特殊负反馈级联反应和炎症因子晚期作用与HF关系密切,其通路与相关因子调控物的研究显得尤为重要,鉴于目前对于HF的发病机制不清且相关因子调控物不多,特异性不理想,而且往往患者存在难以接受的不良反应,这是今后HMGB1-TLR4调控物在抗HF中的研究新方向[27-28]。

3.2 HMGB1-TLR4中药调控物在抗HF中的应用价值 中医通过治未病、针灸、精神调护等多维度、多途径、多靶向的治疗手段,在减轻肝细胞损伤,延缓HF方面做出了重要贡献。由于HF与HMGB1-TLR4关系密切,其通路环节和细胞因子复杂,需要多种调控物的共同作用才有希望在抗HF中发挥明显的优势。中药具有多成分、多环节、多靶点的作用特点,对病理病机非常复杂的HF具有多靶位互补优势。因此,近年来,中医药在与HMGB1-TLR4调控有关的抗HF领域中取得了很多有价值的研究成果。主要体现在以下三个方面。

3.2.1 与HMGB1-TLR4调控有关的中药复方在抗HF中的应用价值 周怡驰等[29]发现,柴芪益肝方加减联合常规方法治疗肝硬化患者102人,发现在降低慢性乙肝HF患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HbsAg含量的趋势和降低HbsAg定量方面明显优于单纯常规治疗的101人。并应用该方法干预CCl4所致C57BL/6 HF模型,发现能明显降低ALT、AST,减轻肝损伤,降低肝组织中α-SMA、Collagen Ⅰ、TGF-β、MDA,升高SOD、GSH-Px,抑制IL-1β、IL6、P65、Smad2/3等的表达。这表明了可从NF-κB调节肝脏炎症反应、氧化应激、肝再生等生物学过程发挥治疗HF的作用,也证明了阻断NF-κB激活的重要性,同时证明了柴芪益肝方的研究价值。黄凌鹰等在研究柔肝方上调肝组织Dectin-1及下调TLR4治疗CCl4造模小鼠HF的作用机制时,证实该方具有较好的抗HF的作用,其机制与上调Dectin-1、下调TLR4的表达有关[30]。三草颗粒是一种临床经验处方,其抗HF作用已被HF患者的临床疗效所证实,临床上广泛应用。Wei等[31]用三草颗粒通过抑制HMGB1、TLR4/NF-κB,从而调控了TGF-β/Smad的信号转导,阻断了HF的进展。表明中药复方的多靶位互补效应在抗HF中具有明显的优势。

3.2.2 与HMGB1-TLR4调控有关的单味中药在抗HF中的应用价值 Wen等[32]研究发现,黄芪(AR)通过干预HMGB1介导的信号通路而减轻HF。AR的干预能显著降低血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、IV型胶原蛋白(COL-IV)等的水平,降低肝组织炎症因子水平、胶原蛋白沉积和HSC活化,并明显降低HMGB1、TLR4、MyD88、RAGE和NF-κB和P65的表达。Hu等[33]发现,连翘水提物(FSE)能呈剂量依赖性下调因TLR4-MyD88-NF-κB信号通路激活引起的p-p65、p-IκBα、IKKβ、IL-6、IL-1β以及LN、PC III、colⅣ等HF标志物。有研究证实,富含三萜类物质的苦瓜叶提取物(TEE),可减少CCl4诱导的HF大鼠模型肝组织中TLR4、TNF-α和IL-6mRNA的表达,下调TGF-β和α-SMA蛋白表达,从而减轻炎症反应和肝细胞凋亡[34]。表明很多单味中药可以通过调控HMGB1-TLR4信号通路中关键细胞因子的表达而发挥抗HF作用,在目前大量抗HF药物与方法均不理想的情况下,抗HF单味中药自然显示出广泛的应用前景和良好的研究价值。

3.2.3 与HMGB1-TLR4调控有关的中药单体成分在抗HF中的应用价值 Cao等[35]研究发现,罗汉果苷IVE明显下调CCl4诱导HF大鼠肝组织中TGF-β1 表达,阻止MAPK磷酸化,减少Collagen Ⅰ、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)等HF标志物。Lin等[36]研究证实,穿心莲内酯可降低CCl4诱导C57BL/6小鼠HF模型血清AST、ALT及肝组织羟脯氨酸含量,其机制与阻断TGF-β1/Smad2/3和TLR4/NF-κB p50信号通路而抑制IL-1β、IL-6的mRNA表达有关。Li等[37]体内外实验均证实,槲皮素能通过干预HMGB1在肝细胞质的易位和NF-κB p65的核易位而抑制α-SMA的蛋白表达与HSC的活化,减轻CCl4诱导的大鼠HF。还有研究证实,山柰酚能明显降低对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤小鼠模型血清ALT、AST、IL-1β、TNF-α、IL-6水平,减轻肝组织炎症反应和肝细胞凋亡,其机制与抑制HMGB1和TLR4的表达及NF-κB的活化有关[38]。这均表明,可望在众多的中药单体成分中找到与HMGB1-TLR4信号通路调控相关的抗HF的理想先导化合物。

4 结束语

总之,作为与HSC活化而诱发HF密切关联的HMGB1-TLR4通路,无论是从其结构与功能,还是从其调控环节或调控因子看,尽管现有相关调控物的临床效果不尽人意,有些还在临床前动物试验阶段中,但随着HMGB1-TLR4信号通路结构与功能研究的深入,其调控物或调控方法也将会有新的进展。这无疑是目前在抗HF方法与药物均不理想前提下有价值的可探之路。中医药具有多成分多靶位互补效应,尤其是与HMGB1-TLR4调控相关的有效成分,是指导筛选抗HF先导化合物的新思路,具有广泛的应用前景和良好的研究价值。