气相色谱法测定2,6-二甲基苯胺中的10种相关杂质

郄一奇,韩静,汤金春,钟毓灵,张皓阅,苏梦翔,3,4*

(1.中国药科大学 药学院药物分析系,江苏 南京 210009;2.常州康普药业有限公司,江苏 常州 225600;3.药物质量与安全预警教育部重点实验室(中国药科大学),江苏 南京 210009;4.国家药品监督管理局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室,江苏 南京 210009)

2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline,2,6-DMA)是苯环上2-,6-位置的氢原子被甲基取代后形成的芳香伯胺,是制备利多卡因、吡咯卡因、布比卡因等酰苯胺类局部麻醉药的关键起始物料之一[1],也常被用于农药、染料、抗氧化剂、香料、合成树脂等的制造[2]。此外,该化合物是利多卡因、赛拉嗪等药物的关键代谢物[3-4],也是一种可能的人类致癌物(2B类致癌物)[5]。

2,6-DMA可由原料间二甲苯经硝化还原制得[6]。基于其生产工艺,原料间二甲苯、中间体2,4-二甲基硝基苯和2,6-二甲基硝基苯、副产物2,4-二甲基苯胺均属于关键杂质需进行质量控制。此外,间二甲苯由混合二甲苯分离制得[7]。间二甲苯中可能含有的邻二甲苯、对二甲苯、甲苯等杂质,也会在后续反应中生成其他二甲基苯胺异构体杂质和甲苯胺异构体杂质。这些异构体杂质结构相似,可能具有相似或者更为严重的毒性[8]。因此,严格控制2,6-DMA中的有关物质和异构体杂质,以尽量减少后续步骤中类似异构体杂质的形成,对于开发更安全、更有效的药物至关重要。2,6-DMA及其相关杂质的化学信息如表1所示。

表1 2,6-DMA及其杂质的化学信息表

目前,已报道的分析方法主要集中于2,6-DMA异构体的分离,多采用衍生化或新型固定相气相色谱法[9-13],操作繁琐,容易产生副产物,适用性不高。Marrisetti等人开发了超高效液相色谱法对6个2,6-DMA异构体和2个降解杂质邻甲苯胺、对甲苯胺进行定量分析[14],但该方法依赖于高性能仪器,且未涵盖原料间二甲苯和中间体2,4-二甲基硝基苯、2,6-二甲基硝基苯等关键杂质。

本研究使用市售毛细管色谱柱对2,6-DMA中的10种杂质(原料、中间体、副产物、异构体杂质、降解杂质)进行直接分离,采用气相色谱外标法进行定量分析,较已有方法操作更加简单、涵盖杂质种类更多、适用性更强。方法已成功运用于盐酸利多卡因起始物料2,6-DMA的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Trace 1310气相色谱仪,含氢火焰离子化检测器、AI 1310自动进样器和Chromeleon 7.2 SR5数据工作站,美国Thermo公司;MSE125P十万分之一电子天平,瑞士Sartorius公司。

1.2 药品与试剂

间二甲苯(纯度99.2%,批号05-Jan-LX41-9-06)、2,4-二甲基硝基苯(纯度98.6%,批号13-Nov-LT18-4-05)、2,3-二甲基苯胺(纯度100%,批号30-Dec-LD98-7-03)、2,4-二甲基苯胺(纯度99.1%,批号11-Jan-LD17-2-05)、2,5-二甲基苯胺(纯度100%,批号27-Sep-LD98-5-03)、3,4-二甲基苯胺(纯度98.7%,批号06-Mar-LD98-8-04)、3,5-二甲基苯胺(纯度100%,批号24-Sep-LD98-6-03)、邻甲苯胺(纯度98.9%,批号04-Mar-LT83-2-02)、对甲苯胺(纯度99.3%,批号06-Mar-LT83-4-02)均购于美国Lovan Research Chemicals公司;2,6-二甲基硝基苯(纯度99.8%,批号21100052)、2,6-二甲基苯胺(纯度99.5%,批号21040820)均购于中国坛墨质检科技股份有限公司;2,6-二甲基苯胺样品(批号20210120、20210310、20210625)均购于常州市如立化工有限公司;甲醇为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱DB-FFAP型毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);程序升温,起始温度为60 ℃,维持10 min,以15 ℃/min的速率升温至110 ℃,维持56 min,再以25 ℃/min的速率升温至200 ℃,维持10 min;进样口温度230 ℃;氢火焰离子化检测器温度235 ℃;载气氮气;流速1.0 mL/min;分流比10∶1;进样量1 μL。

2.2 溶液配制

对照品储备液:取各杂质对照品50 mg,精密称定,分别置5 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL中含10 mg的各杂质对照品储备液。

对照品混合储备液:分别精密量取各杂质对照品储备液500 μL,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL中含500 μg的杂质对照品混合储备液。

对照品溶液:精密量取对照品混合储备液1 mL,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL中含50 μg的对照品溶液。

供试品溶液:取供试品500 mg,精密称定,置10 mL棕色量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL中含50 mg的供试品溶液。

系统适用性溶液:取供试品500 mg,精密称定,置10 mL棕色量瓶中,加适量甲醇溶解,加入杂质对照品混合储备液1 mL,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成系统适用性溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性试验

取空白溶剂(甲醇)、各杂质对照品定位溶液和系统适用性溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图。结果如图1所示,相邻色谱峰分离良好,2,4-二甲基硝基苯&2,5-DMA,2,3-DMA&3,5-DMA,3,4-DMA&未知杂质之间的分离度可达1.98,1.95和1.73。表明该方法专属性好。

时间/mina.空白溶剂;b.间二甲苯;c.2,4-二甲基硝基苯;d.2,6-二甲基硝基苯;e.2,3-DMA;f.2,4-DMA;g.2,5-DMA;h.3,4-DMA;i.3,5-DMA;j.邻甲苯胺;k.对甲苯胺;l.系统适用性溶液。图1 专属性试验的典型色谱图

2.3.2 检测限与定量限

取杂质对照品混合储备液,用甲醇逐级稀释,按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图,分别以信噪比(S/N)为3和10时的溶液浓度作为检测限和定量限。结果如表2所示,各杂质的检测限在2.39～14.94 μg/mL范围内,间二甲苯、2,4-二甲基硝基苯、2,6-二甲基硝基苯、2,4-DMA,2,5-DMA,邻甲苯胺、对甲苯胺的定量限为5 μg/mL;2,3-DMA和3,5-DMA的定量限为10 μg/mL;3,4-DMA的定量限为30 μg/mL。

表2 检测限和定量限、线性的试验结果

2.3.3 线性与范围

取杂质对照品混合储备液适量,用甲醇稀释成浓度在各杂质定量限～200 μg/mL范围内的系列浓度溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图。以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归分析。结果如表2所示,各杂质的相关系数(r)均大于0.990,表明各杂质在相应浓度范围内线性关系良好。

2.3.4 准确度

取9份供试品各500 mg,精密称定,分别置10 mL棕色量瓶中,加入杂质对照品混合储备液适量,分别配制成低、中、高三个不同杂质浓度水平的溶液,一式三份。按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图。结果如表3所示,各杂质的平均回收率(n=9)在88.17%～108.17%范围内,相对标准偏差(RSD)均<10%,表明该方法准确度良好。

表3 准确度、精密度和稳定性的试验结果

2.3.5 精密度

按“2.2”项下系统适用性溶液配制方法制备1份进样精密度溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次并记录色谱图。结果如表3所示,各杂质峰面积的RSD均<5%,表明该方法进样精密度良好。

由两人分别在不同天按“2.2”项下系统适用性溶液配制方法平行配制6份溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图。结果如表3所示,6份重复性溶液中各杂质含量的RSD均<5%,12份中间精密度溶液中各杂质含量的RSD均<5%,表明该方法重复性和中间精密度良好。

2.3.6 稳定性

按“2.2”项下配制1份对照品溶液和系统适用性溶液,室温放置。以4.4 h为间隔,按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图。结果如表3所示,在44 h内,主成分和各杂质峰面积的RSD均<10%,表明对照品溶液和系统适用性溶液室温放置44 h内稳定。

2.3.7 耐用性

按“2.2”项下配制1份对照品溶液和系统适用性溶液,分别在不同初始柱温(60±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL/min、不同进样口温度(230±5)℃、不同检测器温度(235±5)℃条件下进样测定并记录色谱图。结果显示,不同条件下,系统适用性溶液中各杂质与相邻峰之间的分离度均>1.5,各杂质含量的RSD均<10%,表明该方法耐用性良好。

2.4 样品测定

取3批次的2,6-DMA样品,按“2.2”项下供试品溶液配制方法配制供试品溶液,一式两份。按“2.1”项下色谱条件进样测定并记录色谱图。测定结果见表4。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

在溶剂方面,考察了常见溶剂二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和甲醇作为潜在溶剂。结果显示二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺溶剂中含有较多杂质峰。由于待测物种类较多,且异构体之间分离难度较大,为了避免溶剂杂质对待测物出峰产生更多的干扰,最终选择使用甲醇作为溶剂。

3.2 色谱柱的选择

在色谱柱的选择中,测试了不同极性固定相的毛细管柱,如Agilent J&W HP-1(30 m × 0.53 mm × 3 μm)、HP-5(30 m × 0.53 mm × 5 μm)、DB-624(30 m × 0.53 mm × 3 μm)、DB-FFAP(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。结果显示,在强极性色谱柱上,各异构体杂质之间均能得到良好分离,故选择了DB-FFAP型毛细管柱作为试验用色谱柱。

3.3 柱温、流速的优化

由于待测物种类较多,沸点差异较大,考虑采用程序升温色谱法。试验发现,2,4-二甲基硝基苯&2,5-DMA、2,3-DMA&3,5-DMA、3,4-DMA&未知杂质是较难分离的关键杂质对。在其他杂质得到良好分离的情况下,试验进一步探讨了不同初始温度和升温速率对三对关键杂质分离效果的影响。随着上述因素的合理变化,分离效果不显著。最终,通过优化柱流速和第二平台期柱温,在柱温110 ℃、流速1.0 mL/min时,各组分之间实现了良好分离。

4 小结

本研究建立了气相色谱法对2,6-DMA样品中可能存在的10种杂质进行了定量分析,并完成了完整的方法学验证及测样。方法学结果表明提出的方法专属性良好、精密度、准确度高。此方法的优势是对包括合成原料、中间体、异构体杂质等在内的10种杂质进行了分离和定量测定,且无需衍生化等前处理手段。方法简便、可靠,可用于经间二甲苯硝化还原制得的2,6-DMA的质量控制。