NF-κB在ACC-2和CAL-27细胞中的表达及对125I粒子放射敏感性的影响

吴亚东 梁倍铭 赵科 尹鑫海 王亚东 程显林 李永頔

(1 贵州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科,贵州 贵阳 550002;2贵州省人民医院口腔颌面外科)

头颈癌在全球最常见的肿瘤中居第六位,2012年有60多万新发病例和40多万的死亡病例,男性和女性的发病率分别约21.1/10万和12.4/10万〔1〕。对于口腔颌面部来说,最常见的恶性肿瘤是鳞状细胞癌和涎腺癌,它们具有较强的局部侵袭性,其治疗原则是以手术为主,辅以放疗和化疗等的综合治疗。大剂量的外照射理论上可以使肿瘤根治,但同时又与正常组织的耐受是矛盾的,会产生放疗并发症。放疗后出现黏膜炎、皮炎、吞咽困难、张口受限、放射性骨坏死等,针对这些并发症的治疗也颇为棘手。由于放射性125I粒子植入具有高度适形、靶区剂量高、靶区外低剂量的优点,因此既可以治疗头颈肿瘤,又可以大限度地避免或减轻上述并发症的发生。国内外使用这一技术治疗头颈癌,尤其是涎腺癌,取得了良好的效果。本课题组从2006年开始利用放射性125I粒子植入近距离治疗以涎腺癌为主的头颈部恶性肿瘤,到目前为止,取得了令人满意的疗效〔2,3〕。但是在临床应用中发现放射性125I粒子对涎腺癌的疗效好,局部复发率低,而治疗口腔鳞癌的疗效却不令人满意,很多患者在1年内出现了局部复发或转移。因此针对头颈鳞癌患者,放射性125I粒子常被用来与外放疗联合照射治疗因全身疾病或局部晚期而不能手术的患者〔4,5〕。核转录因子(NF)-κB可以调控400多种基因,NF-κB信号通路在炎症反应、免疫应答及肿瘤的发生发展中具有重要作用〔6〕。电离辐射对DNA造成损伤时,细胞会激活相应的信号反应,启动DNA损伤修复反应途径,触发细胞周期阻滞、细胞衰老、细胞凋亡等。如果触发了NF-κB信号通路,通常会阻止细胞凋亡的发生,从而导致细胞放射耐受〔7〕。本研究探讨NF-κB信号通路在腺样囊性癌ACC-2细胞和舌癌CAL-27细胞中的表达及对125I粒放射敏感性的影响。

1 材料和方法

1.1主要仪器和试剂 流式细胞仪(BD公司);多功能酶标仪(BioTek公司);倒置显微镜(Olympus);多光谱成像系统(Nuance公司);实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)仪(ABI公司)。放射性125I粒子源(江苏华益科技有限公司);细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、膜联蛋白(Annexin)Ⅴ凋亡检测试剂盒和噻唑蓝(MTT)细胞活力及细胞毒性检测试剂盒(碧云天公司);NF-κB抗体(Cell Signal公司);各种培养基和胰蛋白酶(凯基生物公司);胎牛血清(四季青公司)。

1.2细胞培养 取对数生长期人腺样囊性癌ACC-2细胞和人舌癌CAL-27细胞系(ATCC,美国),用胰酶消化,离心5 min后重悬,用血细胞计数板和台盼蓝染色计数活细胞浓度,梯度稀释。然后将适量的细胞接种于含有10%胎牛血清、青霉素100 U/ml的RPMI1640培养基细胞培养皿中,在37 ℃,5% CO2的培养箱中培养。

1.3离体照射模型的建立及分组 照射模型参照英国GARY实验室设计的放射性粒子离体照射细胞研究系统〔8〕。2 mm厚聚甲丙烯酸甲酯板支架,分为上下2层,上层为细胞培养板,下层为粒子盘。将8枚7611型125I粒子按等距离分布直径3 cm的圆周上,圆心放置1枚粒子。125I粒子的活度为37 MBq(1 mCi),根据蒙特卡洛建模模拟方法推算出在该离体照射模型下细胞分别受到4 Gy125I持续低剂量率照射,照射时间为43.56 h。实验分为NC组(空白对照)、125I组(细胞接受4 Gy放射性125I粒子低剂量率持续照射)、PDTC 组(选择性NF-κB抑制剂)、PDTC+125I组,(同时加入PDTC和接受125I粒子照射)。

1.4MTT实验 根据MTT试剂盒说明书,将各干预前后的细胞继续培养24 h,消化后制成单细胞悬液,调整细胞密度为每孔4 000～5 000个,接种至96孔细胞培养板中,继续放入37 ℃细胞培养箱中培养72 h。将20 μl MTT溶液加入每细胞孔内,继续孵育4 h。然后将200 μl二甲基亚砜(DMSO)加入培养板中各细胞培养孔中,放置于脱色摇床上振荡10 min,用酶联免疫检测仪测定各细胞培养孔在570 nm波长处的吸光光度值(OD值),将这些光度值记录后绘制以OD值为纵坐标的细胞生长柱状图。

1.5RT-qPCR实验 根据引物设计原则,通过NCBI数据库进行引物设计。引物序列为p65上游5′-CCTTCCAAGAAGAGCAGCGTG-3′,下游5′-ATGA-GAAAGGACAGGCGGCA-3′;GAPDH上游5′-ACAA-CTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游5′-TGGCGTGGGATGATCCTAGA-3′。将实验的各组细胞匀浆后转移至1.5 ml的Ep管中,加入0.2 ml氯仿/ml,Trizol溶液和vortex 15 s,静置10 min,低温离心机离心,吸取含有RNA的上层水相并转移至EP管中,加入0.5 ml Trizol液,混匀,静置后离心,弃上清,洗涤RNA沉淀2次,混匀,低温离心,弃上清液,空干后加入适量焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液,溶解RNA沉淀,备用。制胶,电泳,检测总RNA完整性。根据PCR SYBR Green试剂盒说明书在PCR管中依次加入如下试剂:25 μl FastStart Universal SYBR Green Master (ROX),0.5 μl正向引物 (30 μmol/L),0.5 μl反向引物(30 mol/L),然后用加入不含核糖核酸酶的双蒸馏水。将cDNA样品50 ng加入PCR管中,混匀。PCR扩增条件为95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s,共40个循环。PCR结束后,利用软件分析各个cDNA样品的扩增曲线和溶解曲线,同时用琼脂糖凝胶电泳检测这些扩增产物的特异性;由公式Folds=2-△△Ct计算各样本中的NF-κB p65 mRNA含量及同样本中的GAPDH相对表达量。

1.6Western印迹 本实验制胶浓度为10%。然后取实验细胞进行消化,收集,超声裂解后低温离心,收集上清液。配制不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)溶液,用紫外线分光光度仪分别测定在595 nm波长时各种浓度BSA溶液的光密度值,记录并绘制标准曲线,再测定并记录各组蛋白样品的OD值,按照绘制标准曲线推算的公式计算出每个样品的浓度,给予分装和定量。计算样品体积后对蛋白进行高温变性。向电泳槽内加入缓冲液,然后上样,每孔总蛋白30～50 μg,调节电压100 V、功率50 W、电流300 mA进行蛋白电泳。然后按照阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板的顺序进行转膜。丽春红染色剪膜。用5%的牛奶封闭,按说明书稀释Ⅰ抗,孵育后回收 I 抗。洗膜,加入稀释好的Ⅱ抗,摇床孵育,再次洗膜后曝光。本实验以H2A为内参。用ImageJ软件对电泳条带进行灰度测定及统计分析。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 将各组细胞制成单细胞悬液,按一定浓度接种培养,将消化后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,重新悬浮后加入至离心管内,加入70%乙醇溶液,置于4 ℃环境下过夜,然后离心,弃上清,用冷PBS重悬细胞,再次离心,弃上清。加入500 μl含有100 μg /ml RNase的PBS,37 ℃孵育30 min至1 h离心,弃上清,再加入500 μl含有50 μg /ml的碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素(FITC)的PBS,在4 ℃并避光的条件下孵育20～30 min。再次用离心机离心并弃掉上清液,随后向离心管中加入300～400 μl PBS,将细胞重新悬浮后用流式细胞仪进行读数。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0软件进行独立样本t检验、one-way ANOVA方差分析,并用Bonferroni校正的t检验对各组均数间进行两两比较,用GraphPad Prism6.0进行统计绘图。

2 结 果

2.1MTT实验检测ACC-2和CAL-27细胞照射后的生长活力 照射后,ACC-2和CAL-27细胞的生长较NC组均受到明显抑制(P<0.05),且ACC-2细胞活力明显低于CAL-27细胞(t=3.282,P=0.034)。见表1。

表1 两组ACC-2、CAL-27细胞OD值、NF-κB p65 mRNA及NF-κB p-p65蛋白表达比较

2.2RT-qPCR实验检测ACC-2和CAL-27细胞在照射前后NF-κB p65 mRNA表达 与ACC-2和CAL-27细胞NC组相比,125I粒子照射后NF-κB p65 mRNA表达明显降低(P<0.05);且照射后CAL-27细胞中p65 mRNA表达下降程度明显少于ACC-2细胞(t=2.902,P=0.044)。见表1。

2.3Western印迹检测ACC-2和CAL-27细胞在照射前后NF-κB中磷酸化(p)-p65蛋白表达 照射后,ACC-2和CAL-27细胞中p-p65蛋白表达均较NC组明显升高(P<0.05)。见表1、图1。说明受到125I粒子照射后,两种细胞内的NF-κB均明显活化。

1～4:ACC-2 NC组、ACC-2 125I组、CAL-2 NC组、CAL-27 125I组

2.4流式细胞术检测加入NF-κB抑制剂PDTC前后及ACC-2和CAL-27细胞受照射前后细胞凋亡变化 ACC-2和CAL-27细胞受照射后,PDTC+125I组凋亡率较其余3组明显增加(P<0.05)。见图2、表2。说明PDTC可以通过抑制NF-κB增加ACC-2细胞和CAL-27细胞受到125I照射后的细胞凋亡。

图2 流式细胞术检测各组ACC-2和CAL-27细胞凋亡

表2 各组ACC-2和CAL-27细胞受4 Gy 125I照射、添加100 μmol/L PDTC前后的OD值及细胞凋亡率比较

2.5加入NF-κB抑制剂PDTC检测ACC-2和CAL-27细胞受照射前后细胞活力变化 加入PDTC后,ACC-2和CAL-27细胞受照射后细胞活力较NC组细胞生长明显受到抑制(P<0.05)。PDTC+125I组OD值明显小于其他3组(P<0.05)。说明PDTC可以通过抑制NF-κB来影响ACC-2和CAL-27细胞受到125I照射后的细胞活力。见表2。

3 讨 论

人体组织器官对放射线的敏感性具有差异,总体来说,与其组成细胞的繁殖能力呈正比,与细胞分化程度成反比,即细胞繁殖能力越强的组织器官越敏感。肿瘤细胞的细胞分化程度越低的肿瘤对放射线越敏感。按肿瘤细胞的繁殖和分化能力,可以将肿瘤划分为敏感性高、敏感性较高、中度敏感、敏感性较低和敏感性低五类〔9〕。在影响肿瘤的放射敏感性的各种因素中,肿瘤组织的细胞起源和分化是主要的因素。起源于放射敏感组织的肿瘤对放射线的敏感性较高,分化程度越差的肿瘤其放射线敏感性也越高。鳞状细胞癌和腺癌都属于对放射线中度到低度敏感的恶性肿瘤。但即便如此,手术结合放疗仍是目前公认的治疗头颈鳞癌和涎腺癌最有效的手段。屠规益等〔10〕对229例口腔癌患者分析发现,针对T3、T4病变术前放疗40～50 Gy后,术前放疗组和单纯手术组5年生存率为60.0% vs 29.4%。同时,中国医学科学院肿瘤医院头颈外科对1 215例头颈鳞癌患者5年生存率总结发现手术加放疗的疗效是最好的〔11〕。对于涎腺癌,Lewis等〔12〕认为放疗可以明显降低涎腺癌的局部复发率,而化疗对其愈合并无多大益处。Hosni等〔13〕对304例大唾液腺癌进行术后放疗3D适形放疗或调强放疗,平均随访82个月,局部控制率达96%,预期10年生存率为75%。Yu等〔14〕对405例涎腺癌的生存率进行分析,腺样囊性癌患者接受单纯手术者5年和10年生存率分别为56.6%和34.5%,而手术+放疗组其5年和10年生存率分别为93.3%及68%,差异具有统计学意义。放射性125I半衰期59.4 d,其衰变过程主要通过内部转化产生27、31 KeV的X射线和35 KeV的γ射线。由于其特殊的低剂量率辐射和适当的半衰期,放射性125I已成为目前临床应用最广泛的放射性核素之一。1968年Hilaris等〔15〕率先进行了125I粒子组织间植入治疗鼻咽癌。随后,这种放射性粒子被广泛应用于前列腺癌等多种类型实体恶性肿瘤的治疗,并逐渐成为国内外近距离放射治疗中经常应用的标准核素之一。国内外部分学者及医生使用这一技术治疗涎腺癌,取得了良好效果。Stannard等〔16〕对9例腭部小涎腺癌术后阳性切缘的患者进行35～62 Gy的125I粒子近距离照射治疗,随访32～158个月,没有出现局部复发。有研究用放射性125I粒子组织间植入近距离治疗涎腺癌,取得了良好的效果〔17,18〕。本课题组从2006年底开始应用125I粒子以涎腺癌为主的口腔颌面-头颈癌,取得了令人满意的局部控制率和复发率。我们在临床中发现也放射性125I粒子治疗口腔鳞癌的局部控制率和复发率不如治疗涎腺癌效果好。本实验结果说明,ACC-2细胞比CAL-27细胞对于125I粒子照射更加敏感,验证了临床上放射性125I粒子治疗涎腺癌的疗效比口腔鳞癌的疗效好。1986年,Sen等〔19〕从B淋巴细胞提取物中检测到一种可与免疫球蛋白的kappa链基因增强子序列特异结合的核因子及其抑制因子,即NF-κB及其抑制因子IκBα。最常见的NF-κB二聚体是p65与 p50组成的异二聚体。NF-κB 的抑制单位IκB通过其C末端特定的锚蛋白重复序列与NF-κB结合,并阻止NF-κB向细胞核内转移。在静息的细胞中,NF-κB 和IκB形成复合体,以无活性形式存在于胞质中。当细胞受细胞外信号刺激后,IκB激酶复合体(IKK)活化将IκB磷酸化,使NF-κB暴露核定位位点。游离的NF-κB迅速移位到细胞核,与特异性κB 序列结合,诱导相关基因转录。研究发现,NF-κB信号通路在炎症反应、免疫应答及肿瘤的发生发展中具有重要作用〔20〕。当外界信号作用于细胞后,会启动细胞质中NF-κB信号通路,使NF-κB失去IκBs因子的抑制,促进NF-κB从细胞质转移到细胞核,行使其转录因子的功能,调控靶基因的表达。包括炎性因子、药物、放射线等都会激活NF-κB信号通路,而NF-κB在包括免疫、炎症、细胞凋亡及细胞增殖等多种生物过程中发挥重要的调控作用〔21〕。电离辐射既可以直接将能量传递给DNA从而导致DNA损伤,又可通过产生大量的自由基及活性氧簇(ROS)对DNA造成间接损伤。当DNA损伤时,细胞会激活相应的信号反应,启动DNA损伤修复反应途径,触发细胞周期阻滞、细胞衰老、细胞凋亡等。对于严重的DNA损伤,细胞会通过毛细血管扩张共济失调突变基因(ATM)和Rad3相关激酶(ATR)来识别并传导损伤信号。当细胞出现双链断裂,染色质构造改变产生的信号会诱导ATM发生磷酸化,ATM磷酸化后一方面会将一些DNA修复相关蛋白募集到DNA损伤处,启动DNA损伤修复;另一方面,磷酸化ATM将介导周期监测点蛋白磷酸化,促进G1/S、G2/M期阻滞,为DNA修复提供时间〔22〕。另外,DNA损伤还可以形成ATM/色素失禁症相关基因蛋白(NEMO)二聚体,ATM/NEMO二聚体可以与IKKα/IKKβ结合形成四聚体,然后磷酸化IKBα激活NF-κB。NF-κB的持续活化会阻止细胞凋亡的发生,从而导致细胞的放射耐受。具体来说,NF-κB会与其中的一些下游的靶基因结合,激活这些基因介导的放射抵抗效应〔23〕。另外,NF-κB会通过复杂的信号通路网络将信号交叉传递给蛋白激酶A、磷酯酰激醇-3激酶(PI3)K/蛋白激酶B(AKT)、表皮细胞生长因子受体(EGFR)、信号转录转录激活蛋白(JAK-STATs)等信号通路,从而产生一系列复杂的生物效应影响细胞凋亡〔24〕。通过影响这些信号通路,也可以间接影响NF-κB信号通路介导的细胞放射耐受。本实验结果提示,CAL-27细胞中活化的NF-κB表达较ACC-2细胞中的高,NF-κB高表达和持续活化可能是导致CAL-27细胞较ACC-2细胞对125I粒子更加耐受的原因。本研究结果发现,当NF-κB受到抑制后,两种细胞的放射敏感性都大大增强,进一步说明NF-κB差异表达和活化与ACC-2细胞和CAL-27细胞对放射性125I粒子持续低剂量率照射不同敏感性具有相关性。

综上,在4 Gy的放射性125I持续低剂量率照射下,ACC-2细胞辐射敏感性较CAL-27高,ACC-2和CAL-27细胞的放射敏感性与NF-κB表达和活性有关,且NF-κB在ACC-2细胞和CAL-27细胞中的差异表达和活化可能是二者对放射性125I照射不同敏感性的重要因素,其深入的分子机制需要进一步探讨。