人参总皂苷对萎缩性胃炎大鼠免疫球蛋白及bFGF蛋白的影响

匡晓琴 郭风繁 李卿

(湘南学院附属医院,湖南 郴州 423000)

萎缩性胃炎主要表现为胃黏膜变薄,上皮和腺体萎缩、腹痛、食欲不振、贫血等。幽门螺杆菌(Hp)是萎缩性胃炎最主要的病因,其他原因还包括胆汁反流、长期服用非甾体类抗炎药等药物和酒精摄入,一些少见原因还包括自身免疫机制、遗传因素等。常见诱发因素有焦虑、抑郁等情绪障碍,各种负性社会经历、职业及劳动强度均会对萎缩性胃炎发病产生影响。其典型症状主要表现为非特异性消化不良症状,如上腹痛、腹胀、餐后饱胀及早饱感,进食可加重或减轻,伴随症状可能出现面色苍白、头晕、乏力等表现,这是胃黏膜有明显糜烂时,胃黏膜长期少量出血引起缺铁性贫血所致,可能出现疲软、舌炎、轻微黄疸、肢体麻木等情况,这是自身免疫性胃炎患者由于维生素B12吸收不良,导致的恶性贫血及神经系统症状〔1〕。人参主要成分为人参总皂苷,具有抑制炎症反应,保护神经等作用,但其对萎缩性胃炎相关文献较少,具体作用尚不明确〔2〕。免疫功能紊乱会引起体内炎症增加,免疫球蛋白(Ig)A、IgG、IgM是免疫功能指标,其水平下降表明免疫功能降低〔3〕。当胃黏膜组织糜烂,难以修复时成纤维细胞生长因子(bFGF)表达升高〔4〕。本研究探讨人参总皂苷对萎缩性胃炎大鼠免疫球蛋白及bFGF蛋白的影响。

1 材料和方法

1.1动物与试剂 选取健康ACL雄性大鼠50只,2～4月龄,体质量210～225 g,平均(213.25±12.37)g,购自亿鸣复兴(北京)公司,生产许可证号:SCXK(京)-2019-0001,7 d后开始实验,大鼠常规饲养,室温23.3～27.2 ℃,相对湿度51%～62%,保持12 h光照,正常饮食饮水。试剂:人参总皂苷(西安汇林公司),替普瑞酮(中国卫林药业公司),脱氧胆酸钠溶液(北京百奥莱博公司),免疫球蛋白试剂盒(上海酶联公司),戊巴比妥钠(湖北鸿运隆公司),bFGF、肿瘤坏死因子(TNF)-α一抗(深圳子科公司),辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(河北翰林公司)。

1.2建模分组及给药 取38只大鼠参考相关文献〔5〕建立萎缩性胃炎模型,首先给予大鼠1.5 ml/d脱氧胆酸钠灌胃(0.2%),1次/5 h,再50 ℃ 2 ml热盐水灌胃,运用48 h足量饲养,24 h停饲养的方式,随机剖杀并检测大鼠病理形态,确认建模成功,持续造模8 w后,死亡2只,剩余36只建模成功。模型鉴定标准参照《中药新药临床研究指导原则》(2002)中慢性萎缩性胃炎(CAG)的病理诊断标准〔6〕。12只健康大鼠为健康组,其余36只随机分为胃炎组、对照组、人参组,健康组与胃炎组无处理,人参组灌胃10 mg/kg人参总皂苷,对照组给予50 mg/kg替普瑞酮灌胃,共干预8 w。

1.3苏木素-伊红(HE)染色检测各组胃黏膜组织形态 取各组大鼠,戊巴比妥钠麻醉后处死,取胃黏膜组织,置于4%甲醛缓冲液中固定,石蜡切片,脱蜡,乙醇水合处理,洗涤后进行染色,光镜下观察。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组IgG、IgA、IgM水平 取各组颈部动脉血2 ml,离心5 min,1 250 r/min,取上清,采用ELISA检测各组血清中IgG、IgA、IgM水平。

1.5免疫组化检测转化生长因子(TGF)-β1水平 取各组胃黏膜组织剪切成小块,脱水、包埋后,采用甲醛固定,水化后,37.5 ℃静置后0.5 h后,加入1%的乙二胺四乙酸(EDTA)液,山羊血清封闭。加入1抗(1∶500),加入TGF-β1抗体,加入二抗0.5 h后,复染,封皮。选择不交叉的10个视野,以淡黄色至棕褐色,为阳性,计算阳性率。

1.6逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测重组人音猬因子(Shh)、重组人Patched蛋白(Ptch)、锌指蛋白(Gli)-1水平 取各组胃黏膜组织,裂解液裂解,胰酶消化后将细胞悬液放于试管中。Trizol提取总RNA(严格按照试剂盒进行),,将RNA沉淀于0.1%焦碳酸二酯(DEPC)处理水中,紫外线分光光度计测定浓度。38 ℃恒温1 h进行逆转录后,将cDNA进行荧光反应实验。再将此设为模板,利用特异性引物合成 PCR产物。引物序列:Shh正向:5′-CTCGTCCTACGCAGTCATCG-3′,反向:5′-CCTCGCTTCCGCTACAGATT-3′;Ptch正向:5′-TCTCACAACTCTCGCAATC-3′,反向:5′-ACCTCCACCTTCGCGTCCCT-3′;Gli-1正向:5′-TTCTTCTGCTGACACTCTGGGATA-3′,反向:5′-CCTCAAGTCGACGACACTGCTTA-3′;GAPDH正向:5′-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3′,反向:5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′。以内参为GAPDH,反应条件:3 min 95 ℃,变性30 s 95 ℃;40 s 62 ℃进行40次。5 μl PCR产物作2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,光密度呈现分析结果。计算方法用2-ΔΔCt法进行分析。

1.7Western印迹检测bFGF、TNF-α水平 取各组细胞,胰酶消化,离心,取上清液。用上样缓冲液混合于磷酸盐缓冲液(PBS)稀释蛋白样品中,按照4∶1的比例进行,于沸水中煮沸5 min,二喹啉甲酸(BCA)测总蛋白浓度,每孔上样蛋白量20 μg,电泳。转印缓冲液配制好后于4 ℃冰箱内预冷,后转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脱脂奶粉封闭1 h,TTBS 洗3次,10 min/次;4 ℃过夜,加入1抗(稀释比例1∶500)后PBS漂洗3次,每次间隔10 min,加入辣根根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(稀释比例1∶2 500),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,用博士德生产的二氨基联苯胺(DAB)试剂盒,在1 ml水中加A、B、C液各一滴,再加于膜上,电化学发光(ECL)试剂后凝胶成像系统(JY-Clear)分析目标条带的光密度值。

1.8统计学分析 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组胃黏膜组织病理形态结果 与健康组相比,胃炎组黏膜产生不同程度萎缩并变薄,固有层腺体减少,排列杂乱无章,有炎性细胞浸润。与胃炎组相比,人参组和对照组黏膜腺体数量减少,排列较为有序,炎性细胞浸润减少,以人参组效果最佳。见图1。

图1 各组胃黏膜组织病理形态(HE染色,×400)

2.2各组血清中IgG、IgA、IgM水平检测 健康组血清中IgG、IgA、IgM表达显著较胃炎组高(P<0.05);胃炎组血清中IgG、IgA、IgM表达显著较人参组、对照组低(P<0.05);人参组血清中IgG、IgA、IgM表达显著较对照组高(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清中IgG、IgA、IgM及Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平和bFGF、TNF-α蛋白表达对比

2.3各组胃黏膜组织中Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平 健康组胃黏膜组织Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平显著高于胃炎组(P<0.05);胃炎组胃黏膜组织Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平显著低于人参组及对照组(P<0.05);人参组与对照组Shh、Ptch、Gli-1 mRNA水平比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.4各组胃黏膜组织中bFGF、TNF-α蛋白水平 健康组胃黏膜组织中bFGF、TNF-α蛋白表达水平显著较胃炎组低(P<0.05);胃炎组胃黏膜组织中bFGF、TNF-α蛋白表达水平显著高于人参组与对照组(P<0.05);人参组bFGF、TNF-α表达显著较对照组低(P<0.05)。见表1、图2。

图2 各组胃黏膜组织中bFGF、TNF-α蛋白表达

2.5各组TGF-β1阳性表达检测 健康组胃黏膜组织中TGF-β1阳性率(9.56%)明显低于胃炎组(82.11%;χ2=106.00,P<0.05)。胃炎组胃黏膜组织中TGF-β1阳性率明显高于对照组(35.27%;χ2=45.25,P<0.05)。人参组TGF-β1阳性率(30.24%)与对照组无显著差异(χ2=0.57,P=0.45)。见图3。

图3 各组TGF-β 1阳性表达(免疫组化,×200)

3 讨 论

中医认为萎缩性胃炎属于“痞满”,其位于心下即胃脘处时为胃痞。其中痞代表气隔不通,表现为心下感觉痞满,胸膈胀满,按之柔软且压之无痛。当多种因素损伤脾胃后,将造成水谷运化失调,周身失于濡养,以致病发〔7,8〕。萎缩性胃炎产生时机体的炎症增加且免疫功能下降。免疫功能是机体的一种生理保护功能,可识别机体异物,将其排除或消灭,使机体生理保持平衡。机体受抗原刺激后会产生免疫球蛋白,生成复合体后可组织病原体对机体的损害。免疫球蛋白定位于血液、组织液、分泌液中,是机体的重要防御。人参皂苷是一类固醇类化合物,又称三萜皂苷,可促进免疫细胞再生,提高免疫细胞活性,增强免疫能力。喻媛媛等〔9〕对慢性萎缩性胃炎患者的实验中提出,IgA、IgG、IgM水平在胃炎患者体内为低表达,在经过药物治疗后水平升高,免疫功能提高。杨逸等〔10〕对肝脏进行的实验中提出,人参皂苷可提高的免疫功能,从而起到肝保护的作用。本研究与上述医学者研究结果相似。

刺猬基因(Hh)信号通路具有维持胃黏膜正常结构、功能等作用,可调控胃干细胞、表面黏液细胞等细胞的生物学活性,该通路由Hh信号肽〔Shh,重组人印度刺猬因子(Ihh),人沙漠刺猬因子(Dhh)〕、跨膜受体〔Ptch,人重组蛋白(Smo)〕和下游转录因子(Gli)〔11〕构成。在萎缩性胃炎中Shh表达降低,降低程度与疾病程度相关。其具体机制可能是胃黏膜萎缩使分泌Shh细胞减少,研究表明〔12〕,在Hp感染中,炎性因子通过减少壁细胞的酸分泌,使Shh表达受到抑制。低表达的Shh进一步促进壁细胞萎缩、产酶细胞减少,胃蛋白酶表达降低,胃萎缩加重。现代药理学提示〔13〕,人参总皂苷在体内可起到促进免疫应答的作用,具有一定的抗肿瘤活性。赵唯含等〔14〕提出,Shh、Ptch、Gli-1在经过黄芪与人参皂苷的干预后水平升高,免疫能力增加。本研究与上述研究结果相似。bFGF多存在于内皮组织,可促进血管内皮细胞分化,在体内、外均可促进血管新生。既往研究证实bFGF在维护消化道黏膜完整性及修复黏膜损伤中可调节炎症进程、肉芽组织及上皮细胞的修复有显著促进作用,但如果刺激因素长期存在,导致黏膜糜烂难以修复或反复发作,这使机体内bFGF不断高表达,不断诱导黏膜组织增殖分化,过度增殖正是癌症形成的基础〔15〕。TGF-β1通过与其受体结合可调控细胞生物学行为,并对机体免疫、血管新生具有一定的作用。肿瘤细胞分泌的TGF-β1可促进初始T细胞向具有免疫抑制作用的调节性T细胞分化,通过抑制宿主免疫系统,使肿瘤逃避机体的免疫监视,从而促进肿瘤发生、侵袭和转移。相关实验提出,TGF-β1水平在萎缩性胃炎中的水平高于正常胃黏膜组织,同时机体免疫功能降低,炎症反应增加〔16〕。TNF-α可参与免疫细胞活化炎症反应,具有抗感染等作用,大量TNF-α会使血管通透性增加,导致微血管内凝血产生,致使炎性介质释放,造成黏膜损伤〔17〕,可能是萎缩性胃炎炎症形成初始阶段重要的细胞因子。三七中的主要有效成分是人参皂苷Rg1,具有抗炎、提高免疫功能的作用。刘怀智等〔18〕提出,TGF-β1、TNF-α为正相关关系,在该病中为高表达,经过药物干预后水平有所下降。杨静等〔19〕对在对萎缩性胃炎患者进行的实验研究中提出,bFGF在萎缩性胃炎患者体内为高表达,在经过药物干预后水平下降,胃炎得到一定的治疗。闻丽芬等〔20〕提出,人参总皂苷可通过抑制bFGF水平等促进神经干细胞增加。本研究结果与上述医学者研究结果相似。

综上,人参总皂苷通过提高IgG、IgA、IgM水平提高胃炎大鼠的免疫功能,通过降低bFGF表达,抑制了TGF-β1、TNF-α表达促进Hedgehog信号通路水平,减少了炎症反应,改善病情严重程度,其作用机制可能与抑制bFGF表达有关。