人羊膜上皮细胞对心肌梗死微循环重建的影响

张强 李长春 刘敏 尹熙惠 洪兰 方成虎

(1延边大学附属医院,吉林 延吉 133000 ;2上海市虹口区江湾医院(上海健康医学院附属第一康复医院);3延边大学医学院生理学与病理生理学教研室)

急性心肌梗死(AMI)是供应心脏血流的冠状动脉发生急性闭塞〔1〕。由于血管中斑块、白细胞、胆固醇和脂肪的不稳定积聚,使血液停滞或不能正常流向心脏的某个部位,造成该冠状动脉供血区域的心肌细胞发生损伤、坏死。由于心肌细胞是终末分化细胞,坏死后不可再生,坏死部分心肌功能逐渐减弱,因此,挽救濒死心肌以缩小梗死面积成为AMI治疗的关键。在临床工作中,再灌注治疗依然是目前AMI患者治疗的主要方法,包括静脉溶栓、冠状动脉支架植入术和冠状动脉旁路移植术,以恢复冠脉血流,使缺氧、缺血的心肌细胞得以存活。无法及时接受再灌注治疗或再灌注治疗失败的患者,由于存活心肌细胞的减少往往会发生心肌不良重塑和充血性心力衰竭,甚至死亡。据报道,因为出凝血功能障碍、肾功能衰竭等各种原因,一些患者只能接受保守治疗,却仍然表现出较高的存活率〔2〕。究其原因,可能为某些心脏细胞在某种物质的参与下,进一步分化为血管样细胞并形成新生毛细血管的结果,这引发了坏死心肌局部微循环的重新建立〔3〕。在微循环重新建立后,新生的血管以通畅血流营养缺血、缺氧的心肌细胞,维持心脏的生理功能。有趣的是,这种情况通常发生在前降支、回旋支和右冠状动脉三支血管均堵塞的患者身上,并在严格后续治疗后发现患者日常生活未受明显限制。这提示促进AMI后微循环建立将有助于保护残存心肌细胞的结构和功能。问题是,这种血运重建并不是所有患者都发生,也可能发生的时间较晚。因此,寻求一种促进梗死后微循环重建的方法显得至关重要。细胞替代治疗作为一种独创性的治疗手段及其广大的应用前景引起了临床和基础医学工作者的广泛存眷〔4〕,已成为再生医学中最有前途的领域之一,其核心观念即通过将患者自体或异体细胞移植入受损组织或器官,最终实现缺失部位的替代和功能的修复。中外学者研究发现胚胎干细胞〔5〕、脐带血间充质干细胞〔6〕、人脂肪组织微血管内皮细胞〔7〕等均可诱导心肌组织间隙毛细血管生成。这些干细胞具有来源广泛、容易体外分离、培养及扩增等优点,但也存在诸多问题,如社会伦理争议、细胞之间的免疫排斥反应、致瘤性、疗效不确定性等〔8〕。因此,开发一种能解决上述不足之处的理想细胞来源,便成为当前细胞治疗研究的热点。人羊膜上皮细胞(hAECs)克服了以上细胞的缺点,以其广泛可用性、干细胞特性、低免疫源性、分化可塑性、无致瘤性、容易获取且不涉及伦理问题等优点,成为细胞替代治疗AMI的一个新的发展和研究热点,近10年来受到了越来越多的关注。本文将围绕 hAECs在AMI后微循环重建中的作用及具体机制展开综述。

1 hAECs的简述

hAECs来源于胎盘羊膜组织,且来源于内细胞团,是胚胎细胞,由于在器官发生过程中没有直接受到分化信号的影响,因此可能保留外胚层干细胞样特征和体外三期分化能力〔9,10〕。并且明显具有成熟上皮细胞的许多表型特征,包括细胞角蛋白表达和细胞间紧密连接的形成,能够封闭羊膜腔,帮助维持羊水的成分。hAECs具有表达干细胞标志分子及相关基因的特性,林海等〔9〕通过细胞免疫荧光标记发现hAECs表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3、SSEA-4、肿瘤排斥抗原(TRA)-1-60和TRA-1-81等,运用逆转录-实时聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测出其可表达干细胞全能性相关基因八聚体结合蛋白(OCT)-4、染色体相关性别决定区(SOX)-2、抑制性突变体(Nanog)、遗传变种基因(REX)-1、纤维母细胞生长因子(FGF)-4及端粒酶逆转录酶(TERT)等,这些表达结果显示hAECs具有部分干细胞特性,具有明显的可塑性及多项分化潜能,同时证明hAECs不表达干细胞中端粒酶基因,说明其不可以无限增殖,具有非致瘤性,因此,其在临床治疗中安全性更高。大量研究证实,hAECs在不同生长因子的调节下,可分化为肝样细胞〔11〕、心肌样细胞〔12〕、神经元细胞〔13〕及胰岛样细胞〔14〕等,在细胞替代治疗及组织再生医学上有广阔的应用前景。

2 hAECs治疗MI的潜力

Fang等〔12〕将表达上皮细胞特异性标记pan-cytokeratin的hAECs移植入由液氮制造的AMI大鼠模型后,经过一个月的人工饲养后对大鼠心脏进行切片分析发现,部分hAECs可分化为表达心肌细胞特异性标记肌球蛋白重链(MHC)的心肌样细胞,通过免疫组化及分子生物学分析等实验证实,分化后的细胞有效减少了心脏梗死面积,通过正电子发射型计算机断层显像(PET)及超声心动图等可发现心脏功能得以部分恢复。王钰莹等〔15〕将hAECs移植到左前降支结扎的大鼠模型中,发现hAECs移植组存活的心肌细胞数量较AMI模型组梗死区的更多,心肌细胞纤维化程度更小,左心室重构程度与其相比明显减轻、延缓。但Fang等〔12〕对AMI大鼠模型的细胞移植中,仅有3%的hAECs转化为心肌样细胞,由此可见数量不多的心肌样细胞有可能并不是改善心功能的关键因素,且并未阐明其改善心肌功能的具体作用机制,故hAECs作为一种新型治疗AMI的途径其机制还有待进一步研究证实。

3 hAECs及人羊水来源干细胞来源的内皮细胞(AFSC-EC)对梗死后微循环的影响

Benavides等〔16〕以纤维蛋白-聚乙二醇水凝胶为细胞包封平台,其可促进生物相容性、机械稳定性和血管生成;在共培养中,AFSC和hAECs各作为一种支持细胞来源,类似于间充质干细胞(MSC),发现其能够促进血管长度、面积和厚度的增加;AFSC和hAECs共同衍生的细胞网络清晰形成,血管厚度和覆盖面积与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)-MSC衍生的网络相似,但还需要进一步的分析来确定血管成熟度和体内活力的潜能。Lloyd-Griffith等〔17〕通过对AFSC-HUVEC共培养用于体外胶原蛋白硫酸软骨素(CCS)支架内生成微毛细血管样结构网络,AFSC可发挥周围细胞样细胞的作用,以稳定微毛细血管结构的形成。但其研究发现,缺氧条件对微毛细血管样结构的形成无有利影响,常氧促进了3种O2浓度条件下微毛细血管样结构的形成。这项研究是首次使用含有AFSC的共培养方法成功的预血管化CCS支架(或任何多孔支架)。总的来说,本研究验证了基于AFSC和hAECs的共培养用于血管形成前具有促进作用。

3.1hAECs及AFSC-EC可分化为血管内皮细胞 Liu等〔18〕通过局部肌内将AFSC-EC移植于裸鼠缺血后肢,明显增加血流灌注,治疗效果明显(抢救出11/13只肢体)。这种AFSC-EC在缺血组织中移植的好处可能不是与供体细胞融合或转分化血脑屏障的结果,而是由于新生血管的形成,重新构建缺血部位的微循环,在缺血区域肌内注射AFSC-EC改善了保肢,恢复了血液灌注,显著增加了毛细血管和小动脉密度。此外,移植的AFSC-EC分化为成熟的内皮细胞或平滑肌细胞并融入血管,进而促进包括小动脉在内的新血管的形成。因此,AFSC-EC可能是缺血性疾病再生治疗的一种选择,即可用于AMI的患者,使其坏死区域毛细血管再生,重新构建微循环,使患者心脏功能得以部分恢复。Fazel等〔19〕强调了血运重建的必要性,报道骨髓源性祖细胞通过促进新生血管生成,显著增强心脏修复。因hAECs是比AFSC起源更早的细胞,故其保留较多干细胞特性,因此其也对血管再生机制有着广阔的前景。

3.2hAECs及AFSC-EC的旁分泌因子对血管再生的影响 一些研究表明〔20〕,hAECs表达一些抗血管生成的化学物质,包括血栓反应素-1,内皮抑素和硫酸肝素蛋白聚糖。此外,所有4种金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1,-2,-3和-4都存在于hAECs中,其具有强大的抗血管生成作用。另一方面,也有报道指出hAECs分泌一些血管生成因子,如血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-8 、血管生成素、干扰素、IL-6、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和血小板源性生长因子(PDGF)等〔21〕。基于这些数据,hAECs可以同时具有血管生成和抗血管生成的特性。hAECs诱导血管生成可以用血管生成因子解释,包括:VEGF、IL-8、IL-6、生长相关癌基因(GRO)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、血管内黏附分子(ICAM)和迁移抑制因子(MIF),这些因子都是由hAECs及AFSC-EC分泌的〔22〕。当羊膜分泌的生长因子如成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)-β、EGF、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子等存在时,间充质细胞可分化为内皮细胞。因此,羊膜除了分泌多种血管生成因子外,还可通过间充质细胞向内皮细胞分化,促进血管生成。

旁分泌因子在细胞治疗中起关键作用。通过大量文献及研究可知通过局部控制细胞因子浓度,持续向缺血组织输送旁分泌因子对治疗有好处〔23〕。然而,Liu等〔18〕观察到1个单一肌内注射AFSC-EC上清液并不能改善缺血的保肢或局部血流,说明该治疗不能有效地诱导治疗性血管生成。这种办法失败的根本原因仍待探讨。AFSC-EC上清液可能会被迅速清除,而不会在缺血区域停留足够长的时间以诱导血管生成。提高AFSC-EC上清液治疗效果的策略,如反复肌内注射缺血组织和使用肽纳米纤维控制输送,需要进一步的研究。金属蛋白酶系统(MMPs)已被证明参与了新生血管的形成过程〔24〕。虽然Kim等〔25〕表明MMP-3和MMP-9的表达在MSC的血管生成中起着重要作用,但并没有确定可能参与血管生成通路的因素。VEGF-α在血管生成中起关键作用。已有多篇报道讨论了VEGF-α与MMP-3或MMP-9相互作用的可能性〔26〕,但这些分子相互作用的机制尚不清楚:研究表明,MMP-9刺激VEGF表达〔27〕,而另一些研究认为MMP-9被VEGF激活〔28〕。其研究发现,添加MMP-3或MMP-9抑制剂显著抑制体外毛细血管样血管的形成。MMP-9抑制剂治疗减少了VEGF-α的释放,但MMP-3抑制剂治疗增加了VEGF-α的水平。表明MMP-9可能刺激AFSC-EC释放VEGF-α,从而诱导新生血管,而MMP-3则相反,可能受到VEGF-α的调控,从而诱导血管生成。然而,AFSC-EC治疗作用的机制尚不完全清楚。事实上,AFSC-EC诱导血管生成和动脉生成的改善可能有多种机制。Cohen等〔29〕研究表明,IL-6在血管生成中的作用是通过诱导VEGF,是一种有效的血管生成因子。Song等〔30〕通过研究表明,h-AECs 分泌细胞因子包括血管生长素(ANG)、EGF、IL-6、MCP-1等,这些细胞因子在大鼠MI模型中能够有效地参与心肌修复和功能改进,故进一步研究这些分泌因子的作用机制对开发新型分子疗法治疗MI具有重要意义。

综上,血管生成是一个复杂的过程,成熟的内皮细胞具有有限的再生能力。研究表明,移植的AFSC-EC在缺血的小鼠组织中存活,增加了毛细血管和小动脉的密度,并直接并入缺血部位的小动脉(内皮和平滑肌层)。缺血肢体血流灌注改善可能是缺血部位新生血管的诱导所致。因此,该研究证明了被移植的AFSC-EC在体内分化为成熟的内皮细胞或平滑肌细胞,并融入血管,进而促进包括小动脉在内的新血管的形成。AFSC和hAECs在特定的培养基中培养时能够分化为ECs,AFSC-ECs在基质上形成毛细血管样网络结构。重要的是,研究表明,移植的AFSC-ECs在缺血组织中存活,增强新生血管生成,融入血管组织,改善缺血区域的血液灌注。h-AECs 分泌细胞因子能够有效地参与心肌修复和功能改进,本文认为AFSC-ECs和h-AECs可以作为一种新的异种移植细胞来源,用于治疗缺血性疾病的血管生成。虽然 h-AECs 细胞替代治疗研究至今在临床前实验研究上没有大的进展,但为MI后的缺血再灌注治疗提供了更多参考方案,其在MI治疗的研究潜力是不可估量的。相信其后续研究能有更大进展,并应用到真正的临床实践中。