基于OPG/RANKL信号通路探讨黄精多糖对糖尿病大鼠骨质疏松骨代谢的影响

程妍 张守伟 李宜国

(1日照市中医医院内分泌科,山东 日照 276800;2日照华方中医专科医院内分泌科;3日照市东港区三庄镇卫生院内科)

糖尿病的患病率在世界范围内呈逐年上升的趋势〔1〕。糖尿病骨质疏松(DOP)是一种全身性、代谢性骨病,其骨组织中单位体积内的骨量逐渐减少、导致骨微结构改变,从而引起骨强度逐渐降低、并使得骨脆性增加,容易引起糖尿病骨骼系统的并发症,最终导致骨折的发生〔2,3〕。研究表明〔4〕,糖尿病患者发生骨质疏松的风险高于非糖尿病患者,DOP发病与糖尿病患者年龄及病程直接相关,其发病率也呈逐年上升趋势。黄精多糖(PSP)是中药黄精的主要功能成分,具有抗氧化、抗炎、降低血糖血脂及抗衰老等药理作用〔5,6〕。研究发现PSP能促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化,并可抑制骨质疏松大鼠模型的骨吸收、改善骨流失,起到防治骨质疏松的作用〔7,8〕。此外,PSP还具有降低骨质疏松性骨折大鼠骨钙素(BGP)、抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)、白细胞介素(IL)-1和IL-6的阳性表达活性,降低成骨细胞凋亡率,抑制破骨细胞活性,促进骨折愈合的作用〔9,10〕。本研究通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DOP大鼠模型,并结合骨保护素(OPG)/核因子κB 受体活化因子配体(RANKL)信号通路蛋白表达,探究PSP对DOP大鼠骨代谢的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及实验条件 选取2月龄SPF级雄性Wistar大鼠50只,平均体质量(200±20)g,均购自广西医科大学实验动物中心,动物质量合格证号:SCXK桂2014-0002。所有动物在本院饲养,饲养温度控制在21～25 ℃,相对湿度为50%～60%,自然光照明,自由进食进水,保持饲养环境清洁,适应性饲喂1 w后进行实验分组和造模。

1.2实验药物与试剂 STZ购自美国Sigma公司,纯度98%的PSP(陕西慈缘生物技术有限公司),戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司),青霉素G(北京索宝来生物技术有限公司),血清磷(P)、钙(Ca)、碱性磷酸酶(ALP)、尿Ca、P、肌酐(Cre)检测试剂盒(宁波亚太试剂公司),骨钙素(OC)、脱氧嘧啶啉(DPD)、TRAP、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海西唐生物科技有限公司),OPG、RANKL及β-actin抗体及辣根过氧化物标记的二抗(美国Abcam生物公司)。

1.3实验仪器 高速低温离心机(MICROMAXRF,美国Thermo IEC公司),电泳仪(德国Biometro公司),HITACHI全自动生化分析仪(日本日立公司),RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津),凝胶成像分析系统(美国Alpha公司),双能X线吸收骨密度(BMD)仪(美国GELUNAR公司)。

1.4实验方法

1.4.1BMD大鼠模型建立 50只Wistar大鼠适应性喂养1 w后随机抽取10只大鼠作为对照组,其余大鼠禁食12 h 后,腹腔注射STZ 30 mg/kg(STZ溶解于0.1 mmol/L,pH4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中),对照组腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液。注射后大鼠饥饿3 h,给予3%葡萄糖溶液预防大鼠低血糖,分别于3、7 d后测量大鼠血糖,随机血糖含量≥16.7 mmol/L的大鼠为达到2型糖尿病造模标准。糖尿病大鼠造模成功后与正常对照组大鼠继续正常饲喂20 w,采用双能X线BMD测量仪对正常对照组及糖尿病造模成功大鼠股骨BMD进行测定。取BMD小于正常对照组大鼠平均BMD 2.5个标准差的作为DOP模型大鼠。

1.4.2实验分组及给药方法 将造模成功大鼠随机分为DOP模型组和高、中、低剂量PSP干预(H-PSP、M-PSP、L-PSP)组各10只。对照组和模型组大鼠采用0.9%氯化钠灌胃,10 ml/(kg·d),H-PSP、M-PSP、L-PSP组PSP灌胃量分别为700、400、200 mg/(kg·d),每周称重并根据大鼠体质量调整灌胃量。

1.5指标检测

1.5.1股骨BMD检测 给药8 w后,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,采用双能X线BMD仪扫描各组大鼠左侧股骨。

1.5.2骨代谢指标检测 给药8 w后,毛细玻璃管进行眼底静脉丛取血,静置2 h后高速冷冻离心机离心(3 000 r/mim,15 min)获得血清,-20 ℃保存备用。大鼠禁食24 h收集尿液,离心(3 000 r/mim,10 min)获得大鼠尿液上清液。采用ELISA测定血清中OC、TRAP及尿液中DPD含量。血清ALP、Ca、P及尿Ca、P和Cre含量采用全自动生化仪检测。

1.5.3大鼠股骨组织学检测 深度麻醉后处死大鼠,取下各组右侧股骨组织,用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙3 w后,4%甲醛化学固定48 h,分级乙醇脱水,二甲苯清洗,60 ℃石蜡熔融浸泡过夜,包埋于蜡块内,4 μm切片,采用苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察大鼠股骨组织病理形态学变化。

1.5.4Western印迹检测DOP大鼠股骨OPG、RANKL蛋白表达 给药8 w后,将各组大鼠深度麻醉后处死,取下左侧股骨,剔除附着在胫骨两端和骨干上的肌肉和结缔组织,液氮冷冻30 min后将股骨研磨成粉末。将大鼠股骨粉末中加入蛋白裂解液,高速冷冻离心(12 000 r/min,15 min)收集上清液获取胫骨蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入OPG、RANKL及β-actin一抗室温孵育1 h,随即加入辣根过氧化物标记的二抗室温孵育1 h,加入NCIP/NBT显色,采用凝胶成像系统进行条带灰度分析。

1.6统计学方法 采用SPSS18.0软件进行方差分析、t检验,绘图采用Graphpad Prism5.0。

2 结 果

2.1PSP对DOP大鼠体质量的影响 各组造模前体质量无显著差异(P>0.05),造模后,DOP模型组及不同剂量PSP组体质量显著增加(P<0.05)。给药4～8 w后,H-PSP、M-PSP组体质量均较DOP模型组明显降低(P<0.01,P<0.05),见表1。

2.2PSP对DOP大鼠BMD的影响 给药8 w后,与对照组相比,DOP模型组全身BMD显著降低(P<0.01),PSP各给药组全身BMD均较DOP模型组明显增加,并随PSP药物浓度的增加而增加,其中H-PSP、M-PSP组BMD较DOP模型组显著增加(P<0.01,P<0.05),见表2。

表2 PSP对DOP大鼠BMD、骨代谢生化指标的影响

2.3PSP对DOP大鼠骨代谢生化指标的影响 给药8 w后,与对照组相比,DOP模型组血清ALP、OC、TRAP、Ca和P含量显著升高(P<0.05)。不同PSP剂量组骨代谢生化指标变化不同,各组血清Ca、OC含量均较DOP模型组显著降低(P<0.05),H-PSP组血清ALP、TRAP和P含量均较DOP模型组显著降低(P<0.05),M-PSP组、TRAP、P含量较DOP模型组显著降低(P>0.05),见表2。

2.4PSP对DOP大鼠尿Ca、P及DPD/Cre水平的影响 与对照组相比,DOP模型组尿Ca/Cre、P/Cre及DPD/Cre水平显著升高(P<0.05);与DOP模型组比较,PSP给药组尿Ca/Cre、P/Cre及DPD/Cre水平均显著降低(P<0.05),见表3。

表3 PSP对DOP大鼠Ca、P、DPD/Cre水平及PANKL、OPG蛋白表达的影响

2.5PSP对OPG/RANKL信号通路蛋白表达的影响 与对照组比较,DOP模型组股骨组织中RANKL蛋白表达水平显著升高,而OPG蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。PSP给药处理后,PSP各组股骨组织中RANKL蛋白表达水平均较DOP模型组显著降低(P<0.05);H-PSP、M-PSP组股骨组织OPG蛋白表达水平较DOP模型组明显升高(P<0.05),见表3、图1。

图1 Western印迹检测各组股骨组织RANKL、OPG蛋白表达

2.6PSP对DOP大鼠病理学形态改变的影响 给药8 w后,骨切片镜检结果显示,对照组骨小梁完整,排列整齐、致密,胶原纤维排列整齐。与对照组比较,DOP模型组骨松质部分骨小梁数量明显减少,骨组织内存在大量间隙;与DOP模型组比较,PSP组骨小梁数量增加,排列较规则、紧凑、饱满,PSP处理剂量越高,骨小梁的排列、连续性和完整性越好,见图2。

图2 各组股骨病理学形态(HE染色,×400)

3 讨 论

糖尿病是由遗传易感因素、免疫功能紊乱、精神因素等多种致病因子共同作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质紊乱的一种代谢综合征,主要特点为胰岛素绝对或相对不足。骨质疏松是由多种原因引起的一种以单位体积内骨量减少为特点的额骨代谢障碍性疾病,常以骨折为首发症状。Albright等〔11〕于1941年首次报道了糖代谢与骨代谢之间的关系,证明血糖长期未得到控制的患者容易发生骨质疏松。目前1型糖尿病(T1DM)导致骨量减少已得到证实,而2型糖尿病(T2DM)对骨量及BMD的影响尚无明确定论,国内外对T2DM患者骨代谢的研究得出了BMD正常、增加或降低的结论〔12～14〕,但T2DM患者骨折发生率明显增加已得到证实,其骨质疏松发病率为20%～60%〔15〕。还有研究表明,T2DM患者中女性患者患骨质疏松的概率明显高于男性,这与女性绝经后雌激素水平下降明显有关〔4,6〕。T2DM在中老年群体中发病率较高,骨质疏松为其慢性并发症,二者并发将加速、加重骨质疏松的发生,其导致的病理性骨质,严重影响糖尿病患者的治疗和预后,影响患者的生存质量。

本研究表明,PSP可使骨重建阈值降低,骨吸收与骨形成激活比率降低,同时骨形成大于骨吸收过程,骨丢失减少。BMD是临床诊断骨质疏松的基本依据之一,本实验结果提示糖尿病骨质疏松造模成功。表明PSP能降低DOP大鼠高骨转换率,减少骨量丢失,增加大鼠骨量和BMD,达到治疗。

骨Ca和P是骨矿化的基本物质、是评价骨矿代谢重要的生化指标,骨质疏松患者普遍表现为骨Ca和骨P含量降低,血清Ca和P含量增加。ALP是反映骨形成的生化指标,DOP大鼠模型中,成骨细胞分泌的ALP增加。OC是由成骨细胞合成的成熟骨基质蛋白,参与骨矿化过程。TRAP为骨吸收标志性敏感物,是破骨细胞的标注酶。PSP可降低去卵巢骨质疏松大鼠血清Ca和P含量,通过增加骨对Ca和P的吸收或减少骨矿溶解过程〔6〕。本研究结果提示DOP模型大鼠骨转换率升高、骨吸收增强。表明PSP可对抗DOP大鼠的高骨转换和溶解过程,降低高骨代谢,降低骨转换率。

目前的研究普遍认为,OPG/RANKL/RANK信号通路是破骨细胞激活和分化的主要信号通路〔16〕。OPG广泛分布于人骨髓、心、肝、脾、肺、肾等器官中,成骨细胞或骨髓基质细胞分泌OPG和RANKL竞争破骨细胞或破骨前体细胞上RANK受体,抑制破骨细胞分化和降低骨吸收〔17〕,OPG和RANKL蛋白表达的比例在破骨细胞分化中发挥重要作用〔18〕。严芳娜等〔6〕研究表明,PSP可提高OPG和降低RANKL蛋白表达,抑制破骨细胞活化。何基琛等〔18〕研究发现,PSP能抑制小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化成熟。本研究结果提示,PSP可通过调节OPG/RANKL信号通路从而起到抑制破骨细胞的作用。