氧化应激参与肝纤维化发生发展的研究进展

刘雅妮 郭瑞芳 王欢 娄婷婷 李燕

肝脏是人体最大的消化腺,接受肝固有动脉及门静脉的双重血液供应,营养物质及药物等的代谢、胆汁的合成与分泌、抗体的生成等均在肝脏进行[1]。致病因素可引发肝脏的氧化应激,氧化应激产物活性氧(reactive oxygen species,ROS)诱导肝细胞坏死或凋亡以及肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的增殖、迁移和胶原积累[2],继而引起肝功能损害及细胞外基质(ECM)过度沉积,肝脏弥漫性纤维化,最终导致肝硬化[3]。因此,氧化应激是肝纤维化发生发展的关键[4]。

ROS过量产生可激活转录因子核因子E2相关因子-2(nuclear erythroid-2-related factor 2,Nrf2),Nrf2通过与抗氧化反应元件(antioxidant response elements,ARE)结合,启动下游血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)等抗氧化保护基因的表达,从而生成HO-1等抗氧化酶。研究表明,肝脏疾病、糖尿病、神经退行性疾病、癌症等多种疾病均与Nrf2/HO-1通路相关[5]。

全球每年约有100万人因肝硬化失去生命[6],全球最常见死亡原因中,肝硬化排第11位,是目前肝移植的主要指征,给全球卫生健康工作带来了沉重的负担[7],故深入探究肝硬化的发病机制、诊治策略颇为重要。任何病因导致的肝硬化必定会经过肝纤维化阶段[3],此文综述了肝纤维化过程中氧化应激相关的分子和细胞机制,旨在为临床靶向氧化应激设计新的肝纤维化治疗干预措施提供理论依据。

一、肝纤维化与氧化应激

肝纤维化主要病理表现为肝细胞坏死或凋亡、ECM弥漫性沉积及肝内外血管增殖,各种慢性肝病在转化为肝硬化甚至肝癌时,必定会经历肝纤维化阶段[8]。

生物体内可发生众多氧化还原反应,其中与氧相关的氧化还原反应可产生ROS分子,其在人体正常生理功能如信号转导、细胞周期调节等中发挥重要作用。然而,当其过量生成,超过机体抗氧化系统的清除能力时,则导致氧化应激的发生[9],氧化应激是肝纤维化进程中的始作俑者,多种细胞可产生ROS,亦可被ROS攻击,下面进行分别阐述。

(一)肝实质细胞 肝实质细胞占肝内细胞总数的80%,是肝脏功能的主要组成部分[10],肝细胞中存在着大量可产生ROS的细胞器和酶[2],线粒体呼吸链、细胞色素酶P450家族成员及NADPH氧化酶(NOX)在内的几种细胞机制都能产生ROS[11]。作为肝脏氧化应激的诱导因子,酒精、药物、高脂饮食、肠源性内毒素[12]等均可直接引起慢性肝损伤,从而引发氧化应激;还可作用于库普弗细胞(kupffer cell,KC),诱导ROS产生。过量ROS不仅可作用于线粒体膜、细胞膜等生物膜,发生脂质过氧化反应,生成过氧化产物丙二醛(MDA),损伤生物膜;还可作用于DNA、蛋白质等生物大分子,使其交联聚合,导致肝细胞功能障碍甚至坏死或凋亡。一方面,肝细胞持续凋亡即可诱导纤维化反应[2];另一方面,肝细胞死亡后,可释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β(TGF-β)等炎症因子,放大邻近肝细胞、KC、HSC的炎症及纤维化反应[13]。

(二)KC KC是肝脏特异的常驻巨噬细胞,占肝脏巨噬细胞总数的85%[14],可维持肝组织稳态及对肝损伤迅速反应[3],是产生活性氧的主要细胞[2],既可被促纤维化刺激如酒精、内毒素等直接激活[15],亦可被肝细胞坏死或凋亡时释放的各种损伤相关分子模式(DAMPs,如游离DNA、ATP等)、炎症因子以及致病相关分子模式(PAMPs,如脂多糖或病毒DNA等)激活[3]。其激活后不仅可释放趋化因子、细胞因子、粘附分子等生物活性介质,还可通过NOX2与TLR信号偶联生成过量ROS[11],作用于肝实质细胞及HSC,介导损伤及纤维化。NOX是一种催化分子氧向ROS反应的多组分复合物,包括七种亚型,其中NOX2是人类首次在吞噬细胞中发现的NOX,它在炎症反应和宿主免疫防御中起着重要作用[11],有研究者发现,NOX2缺陷的小鼠HSC的激活及肝纤维化反应均减弱[16]。

(三)HSC HSC存在于肝血窦内皮与肝板之间的Disse间隙,通过其胞质突起与周围的肝细胞、窦内皮细胞、其他HSC以及神经末梢建立密切联系[3]。正常情况下,HSC呈静止状态,在肝脏中主要参与脂肪的储存以及维生素A的贮存、代谢[3]。持续的肝细胞损伤触发炎症因子及ROS释放,以及肝损伤时KC介导产生大量ROS,共同导致HSC的激活,HSC被激活后形态发生变化,胞质脂滴减少,从静止表型转分化为肌成纤维细胞(myofibroblast,MF)表型,产生α平滑肌肌动蛋白、I型胶原、III型胶原等ECM成分[4],导致肝纤维化。HSC是肝纤维化发生发展中最主要的参与者[17],实验和临床数据表明,MF在健康的肝脏中是不存在的,它们是在肝脏损伤时由其前体细胞诱导和激活的[11],无论何种病因所致的肝纤维化,HSC的激活是肝MF的主要来源[18]。

氧化应激是肝纤维化的关键起始步骤,过量ROS既可作用于上述细胞致肝纤维化,还可通过激活NF-κB,促进TNF-α和白介素-6(IL-6)等炎症因子释放,加重炎症反应[19],从而间接增强其致纤维化作用。因此,减轻氧化应激是抑制炎症和肝纤维化的有效策略。

二、肝纤维化与Nrf2/HO-1抗氧化通路

Nrf2由Nfe2l2基因编码,属于帽和领(cap-n-collar,CNC)家族的碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子的一员,具有独特的CNC结构域和高度保守的bZIP结构[20],是含有605个氨基酸的蛋白质,由7个Nrf2-ECH同源结构域,即Neh1-7组成,这些功能域负责维持Nrf2的稳定性及调节其转录活性[5, 21]。其中N端Neh2结构域的两个重要基序DLG和ETGE负责Nrf2与其负调控因子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1[22](Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)的结合[5]。bZIP基序位于Neh1结构域,可介导Nrf2与ARE序列的正确结合,该结构域还可与E2-泛素结合酶相互作用调节Nrf2的稳定性[21]。Neh4和Neh5可以招募环磷酸腺苷效应元件结合蛋白和受体相关辅激活子-3,促进下游靶基因的转录激活[23]。Neh6结构域含有丰富的丝氨酸残基,参与Nrf2的降解[21]。

生理状态下,Nrf2与Keap1特异性结合于细胞质中[8]。Keap1是由624个氨基酸组成的富含半胱氨酸的同二聚体锌指蛋白[24],由5个结构域组成,包括BTB区域、N端区域(NTR)、中间区域(IVR)、双甘氨酸重复区域(DGR)、C端区域(CTR)[25]。其中,DGR区域是其与Nrf2的Neh2结构域结合的区域,BTB结构域为介导Keap1同源二聚化及与Cullin 3-环盒蛋白(Cul3-Rbx)复合物结合的部位[26]。IVR结构域与Keap1在细胞质中的定位相关[27]。BTB和IVR结构域中还存在着在应激反应中可以感应亲电蛋白的半胱氨酸残基,主要包括Cys273、Cys288和Cys151[28]。正常情况下,Keap1与Cul3-Rbx E3泛素连接酶复合体结合,促进Nrf2的多泛素化,从而使其被26S蛋白酶体降解,维持其低活性状态[29]。

当各种肝毒性因素作用于肝脏时,细胞内ROS增加、亲电分子积累,Keap1上关键半胱氨酸残基被氧化,使得Keap1-Cul3-Rbx E3泛素连接酶复合体失活[30],Nrf2降解受到影响,新生成的Nrf2不断积累,进而转位入核,在细胞核内与小肌腱膜纤维肉瘤(small musculo aponeurotic fibrosarcoma,sMaf)蛋白结合成异二聚体,进而识别并结合ARE序列,启动下游抗氧化保护性基因和Ⅱ相解毒酶基因的转录[31],从而生成HO-1、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶[8]。HO-1是其中被广泛研究的抗氧化酶之一,由HMOX1基因编码,又称热休克蛋白-32[32],在NADPH存在下将血红素转化为一氧化碳(CO)、二价铁(Fe2+)和胆绿素;Fe2+通过增加铁蛋白的合成起到抗氧化作用;胆绿素可被胆绿素还原酶还原为胆红素,胆红素亦是一种有效的抗氧化剂[33];CO可激活细胞信号传导的关键酶可溶性鸟苷酸环化酶,起到扩张血管、松弛平滑肌和解聚血小板的功能,亦有抵消促炎细胞因子级联的作用[34]。综上,在氧化应激发生时,HO-1及其产物可通过抗氧化损伤、调节细胞凋亡、调节炎症反应减轻肝纤维化[35]。

有研究者通过制备肝细胞特异性Nrf2缺乏的小鼠模型进行实验,得出了肝细胞特异性Nrf2缺乏小鼠比对照组小鼠对四氯化碳所致氧化应激、炎症反应、纤维化反应更为敏感的结论,进一步证实Nrf2是抵御肝损伤和纤维化的关键因素[36]。亦有学者通过实验证明,间充质干细胞、红树莓提取物等均可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路抑制肝脏氧化应激、炎症和肝纤维化[19, 37]。

三、总结

目前临床用于肝纤维化治疗的药物很少,肝移植是目前治疗肝纤维化最有效的方法,然而,供体器官短缺、费用高昂、免疫排斥反应、手术并发症等诸多因素限制了其广泛开展[19]。

Nrf2 /HO-1信号通路因其可通过抗氧化应激达到抗肝纤维化的目的,成为具吸引力的药理学新靶点,被越来越多的学者关注。研究表明,某些中草药[37]以及天然存在的化合物[38]可能通过激活Nrf2提升抗氧化能力,从而减轻肝脏纤维化,然而由于作用机制尚不够明确等原因,使其临床应用受到限制,应对这部分药物进行深入研究,明确其临床治疗肝纤维化的可行性。

多项研究表明,益生菌可能通过Nrf2/HO-1通路减轻药物、酒精等所致的肝损伤[39],还可减弱肝纤维化患者及动物模型的氧化应激水平[40],增强其抗氧化能力,但关于益生菌能否通过Nrf2/HO-1通路减轻肝纤维化,目前研究较少。益生菌具有肝毒性小、副作用少、与其他药物相互作用少等优点,可通过更多前瞻性临床试验挖掘其潜在益处。

引起肝纤维化的病因诸多,应明确不同病因致纤维化机制的不同,从而进行更有针对性的靶向治疗。应继续研究其他可作用于Nrf2/HO-1通路的激活剂。此外,HSC、KC等在肝纤维化发展中的作用亦至关重要,以HSC为靶点,抑制胶原纤维形成的药物现已在研究。Nrf2/HO-1通路激活剂与其他药物联合使用,多管齐下,可能是减轻肝纤维化的更好的潜在治疗方法。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。