不同成熟度糙皮侧耳风味与能量代谢关系

刘芹，崔筱，吴杰，师子文，胡素娟，宋志波，孔维丽*

（1.河南省农业科学院 植物营养与资源环境研究所，河南 郑州 450002；2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002）

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是我国栽培量第三大的食用菌[1]，不仅含有丰富的维生素、多糖和蛋白质等，而且具有显著的抗病毒、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节活性[2]。此外，糙皮侧耳还具有独特的风味，因而深受消费者的喜爱和认可[3]。糙皮侧耳中的风味成分包括挥发性物质和非挥发性物质（游离氨基酸、5'-核苷酸等）[4]。糙皮侧耳栽培品种类型、栽培方法、采用菌柄或菌盖以及成熟度对这些风味物质的产生都有重要影响[5]。目前，对糙皮侧耳的研究主要集中在栽培[6]和生物活性成分上[2]，而新鲜子实体的风味随子实体生长发育而发生变化的研究鲜有报道。

已有研究表明，水果、蔬菜及食用菌的成熟、衰老、褐变等生物学特性与其能量代谢密切相关[7]。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是生物活性和细胞功能的重要基础，是生物体中最重要的高能磷酸盐化合物[8]。在能量转移过程中，ATP 会脱去磷酸基团转化为二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）[8]。细胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）、三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）、琥珀酸脱氢酶（succinic dehydrogenase，SDH）等能量代谢相关酶在ATP 合成的调控中发挥着重要作用，因而对生物的能量代谢具有显著影响[9]。糙皮侧耳子实体的发育通常分为3 个典型的生长阶段，即生长初期、中期（未成熟期）和成熟期[10]。目前，对不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体的能量代谢研究相对较少。

因此，本研究探索不同成熟度的糙皮侧耳新鲜子实体中风味和能量代谢的变化，以及能量与风味的关系。研究结果可能对高风味质量糙皮侧耳子实体的获得提供新的调控途径，并为整个食用菌产业提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

糙皮侧耳菌株黑平17-1：河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所选育[（2018）第2018002 号，河南省种子管理站认定品种]，栽培地点为河南农科院原阳二基地。

1.1.2 试剂

氨基酸、5'-核苷酸标准品（色谱级）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲醇（色谱级）：美国Dikma公司；ATP、ADP、AMP 标准品（色谱级）：北京索莱宝科技有限公司；CCO、ATPase、SDH 酶联免疫分析试剂盒：上海江莱生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

5810R 高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；AL204 电子天平：Mettler-Toledo 仪器（上海）有限公司；ECAN Infinite 200 Pro 多功能酶标仪：瑞士TECAN公司；KQ-数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；P393 破壁机：九阳股份有限公司；L8900 氨基酸自动分析仪：日本Hitachi 公司；UltiMate 3000 高效液相色谱仪：美国Thermo 公司；7890A 气质联用仪：美国Agilent 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 子实体栽培、样品采集及预处理

栽培方法参照Kong 等[3]糙皮侧耳发酵料栽培技术。在子实体发育的5 个时间点采摘大小一致、无机械损伤、无病虫害的糙皮侧耳，采收后的子实体样品用保鲜袋分装，再放入加有冰块的泡沫纸箱，运回实验室后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 游离氨基酸测定

游离氨基酸的提取和分析参考Liu 等[11]的方法。糙皮侧耳新鲜子实体匀浆（1.0 g）加入100 mmol/L HCl溶液，25 ℃下振荡30 min。5 000×g 离心10 min 后，取5 mL 上清液加入等量5%磺酰水杨酸溶液中。混合液在25 ℃黑暗中静置30 min，然后用0.22 μm 的微孔滤膜过滤，滤液用氨基酸自动分析仪进行检测。游离氨基酸含量以g/kg 表示。

1.2.3 5'-核苷酸测定

5'-核苷酸的提取和分析参考Liu 等[11]的方法。糙皮侧耳新鲜子实体匀浆（5.0 g）加入20 mL 蒸馏水，煮沸1 min，冷却后5 000×g 离心10 min，残渣再次用蒸馏水提取。合并上清液，用蒸馏水定容至50 mL，微孔滤膜（0.45 μm）过滤。滤液采用装备有LiChrospher RP-18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的高效液相色谱仪进行分析。5'-核苷酸含量以g/kg 表示。

1.2.4 等效鲜味浓度（equivalent umami concentration，EUC）计算

等效鲜味浓度的计算参考Yamaguchi 等[12]的方法，以g MSG/100 g 表示。

Y=∑aibi+1 218∑aibi∑ajbj

式中：Y 为混合物的EUC，g MSG/100 g；ai为单个鲜味氨基酸（Glu 或Asp）的浓度，g/100 g；aj为单个鲜味5'-核苷酸（5'-GMP、5'-IMP 或5'-XMP）的浓度，g/100 g；bi为单个鲜味氨基酸相对于味精的相对鲜味值（Asp为0.077；Glu 为1）；bj为单个鲜味5'-核苷酸相对于5'-IMP 的相对鲜味值（5'-IMP 为1. 0；5'-GMP 为2. 3；5'-XMP为0.61）；1 218 为所使用浓度的协同常数，g/100 g。

1.2.5 挥发性物质测定

根据Liu 等[13]的方法，采用顶空固相微萃取结合气质联用仪（headspace solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）对糙皮侧耳新鲜子实体的挥发性成分进行提取。GC-MS 分析在装备有DB-5 ms 毛细管柱（30 m×0.25 m×0.25 μm）的气质联用仪上进行。挥发性物质含量按面积归一化法进行定量分析。

P=（A/T）×100

式中：P 为各分离组分相对含量，%；A 和T 分别为各分离组分的峰面积和总峰面积。

1.2.6 AMP、ADP 和ATP 含量及能荷分析

ATP、ADP 和AMP 的提取和测定参考Liu 等[13]的方法。糙皮侧耳新鲜子实体匀浆（5.0 g）与6 mL 0.6 mol/L预冷KClO4混合，冰浴抽提。9 000×g、4 ℃离心10 min后，在上清液（3 mL）加入1.0 mol/L KOH 使溶液pH 值降至6.8，冰上静置30 min 以沉淀KClO4。9 000×g、4 ℃离心5 min，上清液采用蒸馏水定容至5 mL。0.45 μm微孔滤膜过滤后，采用装备有Agilent ZORBAX Extend-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的高效液相色谱仪测定ATP、ADP 和AMP 的含量。通过与标准品比较进行AMP、ADP 和ATP 的鉴定和量化，并以mg/kg表示。能荷（energy charge，EC）计算公式如下。

E=（T+0.5D）/（T+D+M）

式中：E 为能荷，mg/kg；T、D 和M 分别为ATP、ADP和AMP 的含量，mg/kg。

1.2.7 能量代谢相关酶活性测定

SDH、CCO、H+-ATPase、Ca2+-ATPase 4 种与能量代谢相关酶的活性采用酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，按照说明书进行测定。将新鲜平菇子实体（5.0 g）加入25 mL 预冷生理盐水，匀浆，4 ℃提取8 h。9 000×g、4 ℃离心10 min，收集上清液用于酶活测定。每单位（U）的CCO 活性表示使550 nm 处吸光度每分钟增加0.01 所需酶量；每单位（U）的SDH 活性表示使600 nm 处吸光度每分钟增加0.01 所需酶量；每单位（U）的ATPase 活性表示每分钟催化释放1 μmol 磷酸基团所需酶量。采用Bradford 法测定可溶性蛋白含量[14]。酶活性以U/mg 蛋白表示。

1.3 统计分析

数据以平均值±标准差表示。图表采用Microsoft Excel 2016 构建。使用SPSS v.20 对数据进行单因素方差分析（ANOVA），使用Duncan's post-hoc tests 进行显著性分析，P<0.05 表示具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 生长曲线

5 个不同成熟度的糙皮侧耳新鲜子实体外观如图1a 所示，子实体平均质量如图1b 所示。

图1 不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体外观和平均质量Fig.1 Appearance and average weight of Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity

由图1a 可知，子实体叠生，菌盖扇形，黑灰色。菌柄于T1 时期形成，至T5 时期完全伸展。T5 时期，子实体完全成熟，菌盖边缘上卷，菌褶完全打开，孢子大量弹射。由图1b 可知，子实体的初级发育阶段（T1～T3）为缓慢生长阶段，中期（T4）和成熟期（T5）为快速生长阶段，此时子实体趋于成熟。糙皮侧耳的这种现象与双孢蘑菇（Agaricus bisporus）不同，双孢蘑菇子实体发育起始阶段生长极其迅速，菌盖直径可在1 d 内翻倍。大约在3 d 之后，菌盖直径增长速度放缓为指数增长，直至内菌幕破裂[15]。

2.2 挥发性物质变化

生物体中天然挥发性物质可用于防御或作为次生代谢产物。挥发性物质通常具有一种独特的气味，可以分散到空气中，从而显著影响消费者对食品品质的感知[16]。不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体中挥发性物质含量如表1 所示。

表1 不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体中的挥发性物质含量Table 1 Content of volatile compounds in Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity%

由表1 可知，T1、T2、T3、T4 和T5 中分别鉴定出20、25、26、22 种和17 种挥发性物质，主要包括八碳化合物、醛类、醇类、酮类和其他类化合物。本研究中，八碳化合物是糙皮侧耳新鲜子实体中的主要挥发性成分，其由酶（如脂氧合酶和过氧化氢裂解酶）和不饱和脂肪酸（如亚油酸）经过一系列代谢过程形成。八碳化合物具有较低的气味阈值，是食用菌独特风味的主要来源[17]。糙皮侧耳新鲜子实体中八碳化合物占总挥发性物质的87.88%～93.86%。其中常规采收期即T3 和T4 时期采收的新鲜子实体中八碳化合物的相对含量最高，分别为92.71%和93.86%。本研究中鉴定到的主要八碳化合物为3-辛酮、3-辛醇和1-辛烯-3-醇。其中，1-辛烯-3-醇又称蘑菇醇，主要存在于新鲜食用菌中。T1、T2、T3、T4 和T5 时期采收的子实体中，其相对含量分别为13.58% 、49.97% 、18.02% 、14.00% 和42.50%，呈先增加后降低再增加的趋势，T2 和T5 时期的1-辛烯-3-醇相对含量较高。这一结果与Li 等[18]的研究结果不同，其发现松茸（Tricholoma matsutake）中的主要挥发物1-辛烯-3-醇和肉桂酸甲酯的含量随着子实体的老化而逐渐降低。

2.3 游离氨基酸、5'-核苷酸及EUC 的变化

与蔬菜的营养成分相似，食用菌的鲜味成分也受其成熟度的影响[19]。不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体中游离氨基酸和5'-核苷酸含量如表2 所示。

表2 不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体中的游离氨基酸和5'-核苷酸含量Table 2 Contents of free amino acids and 5'-nucleotides of in Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity g/kg

由表2 可知，糙皮侧耳新鲜子实体中含有17 种游离氨基酸。游离氨基酸总含量在20.74～34.87 g/kg 之间，T2 时期达到峰值，此后随子实体成熟度的提升而显著降低（P<0.05），该结果与Tsai 等[20]研究结果一致。在食用菌和水果中，游离氨基酸含量对挥发性物质的产生和积累具有重要影响[16，21]。激活氨基酸降解可以生成三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环中乙酰辅酶A 前体，从而维持能量的产生，并且导致挥发性物质形成所需特定底物的积累[21]。因此，游离氨基酸含量的变化可能对糙皮侧耳子实体发育过程中挥发性物质的含量和能量水平的变化有重要影响。味精样氨基酸，主要指Glu 和Asp，有助于食用菌鲜味特征的形成[22]。在本研究中，T1（8.68 g/kg）和T2（8.52 g/kg）时期采收的糙皮侧耳新鲜子实体中味精样氨基酸含量较高（P<0.05），后期含量逐渐降低。这一发现与杏鲍菇中的味精样氨基酸随子实体发育而呈现的变化趋势相似[17，23]。Yang 等[22]研究发现，味精样氨基酸的含量可分为3 个级别：低（<5 g/kg）、中（5～20 g/kg）、高（>20 g/kg）。因此，本研究中糙皮侧耳新鲜子实体中味精样氨基酸含量（5.16～8.68 g/kg）所处级别为中。

除游离氨基酸外，5'-核苷酸也会对食用菌的鲜味产生重要影响[22]。不同成熟度的糙皮侧耳新鲜子实体中的5′-核苷酸含量具有明显差异。其中，5′-GMP 和5′-UMP 含量随成熟度提升而显著增加，T3 时期达到峰值（分别为0.88 g/kg 和0.33 g/kg），此后逐渐下降。5′-CMP 含量随子实体成熟度的提升则呈降低-升高-降低-升高的趋势。T1、T2、T3、T4 和T5 时期的5′-CMP含量分别为0.26、0.17、0.45、0.33 g/kg 和0.34 g/kg。5'-IMP 和5'-XMP 的含量在各成熟度均较低，且随成熟度提升而发生的变化不显著。因此，它们对鲜味的贡献远小于5'-GMP。鲜味5′-核苷酸（5′-GMP、5′-XMP、5′-IMP）含量随成熟度提升而逐渐增加，并在T3 时期达到峰值（0.90 g/kg）。双孢蘑菇中的鲜味5'-核苷酸含量随子实体的发育也呈现出类似的变化趋势[20]。但这些结果与Mau 等[24]的研究结果不一致，随着草菇成熟度的提升，总5′-核苷酸和鲜味5′-核苷酸的含量呈逐渐增加的趋势。

Mau 等[25]将EUC 划分为4 个级别，I：大于1 000 g MSG/100 g（干重）；II：100～1 000 g MSG/100 g（干重）；III：10～100 g MSG/100g（干重）和IV：小于10 g MSG/100 g（干重）。如表2 所示，糙皮侧耳新鲜子实体中的EUC在25.89～111.25 g MSG/100 g（鲜重）之间波动，约为209.99～902.26 g MSG/100 g（干重）。因此，糙皮侧耳新鲜子实体的EUC 为II 级。T3 时期采收的糙皮侧耳新鲜子实体中的EUC 显著高于其他时期。传统糙皮侧耳生产中，糙皮侧耳常于T4 时期采摘，产量高效益好。而近几年，消费者越来越青睐T3 时期采摘的糙皮侧耳，此时口感更好，这与本研究中T3 时期采摘的糙皮侧耳具有最高的EUC 相一致。T5 时期，糙皮侧耳子实体菌盖边缘上卷，菌褶完全暴露，子实体过度成熟，EUC 显著降低。该研究结果与Tsai 等[20]和Chen 等[23]的结果不同，不同成熟期采收的双孢蘑菇和香菇的EUC分别为207～284 g MSG/100 g（干重）和106.8～342.7 g MSG/100 g（干重），其EUC 峰值分别为T5 和T1 时期。结果表明，食用菌鲜味成分的含量因食用菌的成熟阶段和品种不同而具有显著差异。

2.4 AMP、ADP、ATP 含量及能荷

蔬菜、水果和食用菌的发育、成熟和衰老与其细胞能量水平密切相关，而生物体中的能量水平可以采用AMP、ADP、ATP 含量和EC 来表示[8-9]。不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体中AMP、ADP、ATP、总腺苷酸含量以及EC、ATP/AMP 如图2 所示。

图2 不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体的能量状况Fig.2 Energy status of Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity

如图2a 所示，T2 时期的糙皮侧耳新鲜子实体中的ATP 含量（17.48 μg/kg）显著低于T1 时期（23.06 μg/kg）（P<0.05）。T1 时期的能量水平高可能是由于糙皮侧耳从营养生长过渡到生殖生长时需要大量的能量。子实体中的ATP 含量在T3 和T4 时期呈增加趋势，并于T4时期达到峰值（62.37 μg/kg），此后急剧下降（9.47 μg/kg）。此结果与Qiu 等[26]的研究结果类似，随着荔枝果实发育，ATP 含量显著增加，而在衰老过程中ATP 含量显著下降。研究表明，细胞能量的供应是控制成熟和衰老的关键因素，水果和蔬菜的软化和衰老可能与细胞中能量供应不足或其产生效率的降低密切相关[27]。由图2b 可知，ADP 含量的变化趋势与ATP 含量相似，T4 时期含量最高（74.43 μg/kg）。由图2c 可知，AMP 含量呈现出相反的变化趋势，T4 时期含量最低，为142.75 μg/kg。由图2d 可知，总腺苷酸含量在幼嫩子实体中相对稳定，但在T4 时期急剧增加，T5 时期则显著下降。EC 是指总的腺苷酸系统中所负荷的高能磷酸键的数量（即ATP，ADP 和AMP 含量之和）[8-9]。由图2e 可知，子实体中的EC 呈降低再升高后降低的趋势，T1～T5 时期的EC 分别为0.19、0.14、0.18、0.35 和0.07。高水平的EC抑制ATP 的产生，同时促进ATP 的利用，即促进机体的合成代谢[7]。因此，糙皮侧耳子实体在T3～T5 期间生长迅速。由图2f 可知，ATP/AMP 比值在T4 时期达到峰值，之后急剧下降，这一现象可能意味着糙皮侧耳孢子即将释放，子实体将从成熟转换到衰老，与Wang等[7]的结果类似，荔枝果实的ATP/AMP 在开花后80 d（DAF，八成熟）达到最大值，此后逐渐下降，直至完全成熟。

2.5 与能量代谢相关的酶活性

植物细胞主要通过线粒体反应产生能量，包括线粒体电子传递链（mitochondrial electron transport chain，mETC）和TCA 循环[28]。Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH和CCO 是这些反应中的关键酶。Ca2+-ATPase 和H+-ATPase 通过将ATP 转化为ADP，在能量的合成和供应中起着关键作用[29]。CCO 是一种位于mETC 末端的关键酶，在氧化磷酸化过程中对有氧代谢和能量的产生至关重要[30]。SDH 通过促进琥珀酸向富马酸的代谢而产生ATP[31]。越来越多的研究表明，果实在采前发育和采后衰老过程中，参与能量代谢的酶活性发生了显著变化[7]。不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体中的H+-ATPase、Ca2+-ATPase、CCO 和SDH 活性如图3 所示。

图3 不同成熟度糙皮侧耳新鲜子实体中能量代谢相关酶活性Fig.3 Activities of enzymes involved in energy metabolism of Pleurotus ostreatus harvested at different stages of maturity

如图3 所示，糙皮侧耳子实体发育过程中Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH 和CCO 活性发生了显著变化。在生长过程中，各酶活性均呈现出降低再增加后降低的趋势，均在T4 时期达到最大值。这与能量状态的变化相对应。由此表明，糙皮侧耳子实体快速生长时期TCA 循环和氧化磷酸化的速率较快，从而导致线粒体能量的产生较多。T5 时期糙皮侧耳子实体开始衰老，与能量代谢相关的酶活性则显著降低（P<0.05），这可能是由于此时糙皮侧耳的生理代谢发生了变化，一方面抑制了线粒体内的电子传递；另一方面促进了活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的增加[27]，而过高的ROS 损害线粒体的结构和功能，进一步对线粒体呼吸链产生有害影响。因此，T5 时期采收的糙皮侧耳子实体能量相关酶活性和能量水平显著降低（P<0.05）。近年来，有关食用菌、蔬菜和水果采后贮藏过程中能量状态变化的研究报道较多，而有关发育过程中能量代谢的变化则有待进一步研究[8，32]。

2.6 糙皮侧耳风味与能量的相关性

近年来，鲜味和挥发性物质的研究主要集中在成分和含量的变化上[16]，而有关食用菌子实体发育过程中风味和能量状态之间关系的研究非常有限。本研究分析了八碳化合物、鲜味成分与能量状态之间的关系。统计分析表明，总八碳化合物含量与EC（相关系数=0.486，P<0.01）、ATP（相关系数=0.428，P<0.05）、ADP（相关系数=0.373，P<0.05）显著相关。此前有报道发现，外源ATP 通过调控LOX 途径和脂肪酸合成，显著增加了“南果”梨中总挥发性酯的含量和种类[33]。因此，认为糙皮侧耳子实体发育过程中ATP 和EC 的增加，在提高挥发性物质合成相关酶活性和前体物质方面发挥了重要作用，从而增强了挥发性物质（八碳化合物）的合成能力。此外，EUC 与Asp（相关系数=0.906，P<0.01）和Glu（相关系数=0.782，P<0.01）含量呈显著正相关，同时也与5'-GMP 含量（相关系数=0.913，P<0.01）和5'-UMP 含量（相关系数=0.645，P<0.01）呈显著正相关。此外，还对八碳化合物、鲜味成分与能量代谢相关酶的相关性进行了分析。结果表明，糙皮侧耳的CCO 活性与EUC 显著正相关（相关系数=0.472，P<0.01）。这些结果与Zhang 等[9]的研究结果不一致，其认为秀珍菇的SDH 活性与EUC 显著相关（P<0.05），这可能是由于食用菌品种不同。糙皮侧耳CCO 活性与总八碳化合物的含量呈显著正相关（相关系数=0.472，P<0.01），还与GMP 含量（相关系数=0.622，P<0.01）、UMP含量（相关系数=0.405，P<0.05）和XMP 含量（相关系数=0.446，P<0.05）具有显著的相关性。据报道，Gly、Glu和Asp 可作为合成嘌呤和嘧啶核苷酸的原料，且所有的氨基酸脱氨基后都可以转化为乙酰辅酶A，从而参与能量代谢[16]。因此，能量代谢相关酶（CCO）活性的变化可能直接或间接影响氨基酸和5'-核苷酸的含量，从而改变食用菌的风味。基于此，研究结果表明糙皮侧耳的风味与其能量状态密切相关，并且CCO 可能是影响糙皮侧耳风味的关键酶。

3 结论

不同成熟度的糙皮侧耳新鲜子实体中的风味成分（游离氨基酸和5'-核苷酸）和能量代谢成分明显不同，从而导致糙皮侧耳品质具有显著差异。其中T3 时期采收的糙皮侧耳新鲜子实体EUC 最高，而T4 时期的八碳化合物总含量、能量水平以及能量代谢相关酶活性最高。此外，糙皮侧耳中的挥发性物质（总八碳化合物）与EC 和能量物质含量（ATP 和ADP）显著相关（P<0.05）。能量代谢相关的酶（CCO）活性与EUC 及5'-GMP、5'-UMP、5'-XMP 和总八碳化合物含量具有显著相关性，表明CCO 可能是影响糙皮侧耳风味的关键酶。然而，还需要进一步研究CCO 如何在分子水平上影响糙皮侧耳风味。