基于抗病毒活性检测的中药板蓝根质量控制研究

张丽,何燕,马祖文（新疆医科大学第五附属医院,新疆 乌鲁木齐 830000）

板蓝根来源于十字花科植物菘蓝的根，在流感等感染性疾病的治疗中较为常用，具有确切的临床疗效[1]。现版《中国药典》定性板蓝根质量控制的依据主要为精氨酸薄层鉴别，但板蓝根具有复杂的化学成分，缺乏明确的药效物质，在其质量控制中，精氨酸鉴别意义不大[2]。在中药质量研究中，将中药质量生物控制模式建立起来已经成为发展趋势，特别是一些中药品种，测定含量时缺乏指标性成分，将生物活性检测方法建立起来能够对现有质控水平进行完善并使其提升[3]。要想使中药质量生物控制得以实现，关键是要将生物活性测定方法优化并建立起来，并保证其与药品检定要求相符，和药效相关[4]。本文研究了中药板蓝根基于抗病毒活性检测的质量控制。现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 药材与试剂 板蓝根药材来源于十字花科植物菘蓝的干燥根。NA底物。

1.2 主要仪器 荧光酶标检测仪（FLUOstar OPTIMA，BMG公司），荧光酶标板（96孔，COSTAR公司），V型微量板（96孔，姜堰市新康医疗器械有限公司）。

1.3 细胞系、病毒株与NA 1%红细胞：用PBS与兔红细胞制作1%红细胞混悬液，保存在4℃的温度下备用；流感病毒：A/PR8/34；NA制备：培养细胞，接种病毒，将滤除细胞的病毒液取出，灭活，除菌过滤后分装，作为NA原液保存在-70℃的温度下。

2 实验方法

2.1 板蓝根红细胞凝集活性测定方法

2.1.1 供试品溶液制备 将本品粉末取出，过三号筛，精密称定，放置于圆底烧瓶中，精密量取10倍量乙醇溶液加入其中，将重量称定，加热回流40min，放冷，然后将重量称定，用乙醇将减失的重量补足，摇匀，滤过，精密量取续滤液，水浴蒸干，用PBS溶解残渣，取出上清液，除菌过滤。直接用PBS溶解阳性对照药，制成1mg/ml初浓度。

2.1.2 测定法 在V形微量板（96孔）上用PBS两倍系列稀释供试品溶液，每个供试品溶液做两排，每孔加入50μl，将50μl PBS加入到每排最后1孔中，将其设定为阴性对照。然后将50μl 1%红细胞混悬液加入到每个孔中，以轻柔的动作对微量板进行拍打30s，混匀，在4℃的温度下静置2h，对结果进行观察。

2.1.3 结果判定 在白色背景上放置微量板，比较供试品孔和阴性对照孔，阳性（+）判定标准为红细胞没有全部在底部沉积，一些在孔壁上附着，或有一层红细胞均匀附着在孔壁上；阴性（-）判定标准为红细胞在底部沉积成一规则的圆点，没有红细胞附着在孔壁。本品效价为供试品出现阳性的最高稀释倍数。

2.2 板蓝根红细胞凝集活性和抗病毒活性相关性实验

2.2.1 板蓝根抑制NA活性的测定 依据已建立的板蓝根抑制NA活性测定步骤与方法测定。

2.2.2 数据处理 板蓝根对NA抑制活性的反应抑制率计算公式为：（I）=（酶活性对照荧光-样品作用后荧光）/（酶活性对照荧光-背景荧光）×100%。

2.2.3 相关性统计方法 将自变量、应变量分别设定为NA抑制活性、红细胞聚集效价，将统计分析样品设定为上述20份药材，运用直线相关分析方法对两种方法检测结果的相关性进行考察。采用SAS 8.12统计软件计算直线相关分析。

3 结果

3.1 板蓝根对红细胞的凝集活性观察 将供试品溶液制备出来，组成成分为三批板蓝根样品与阳性对照药PHA-p，检测红细胞凝集活性，反应前后分别在显微镜下观察，发现板蓝根和阳性对照药对红细胞的凝集活性均显著。

3.2 方法学验证

3.2.1 供试品溶液稳定性 将同批板蓝根粉末取出，制备供试品溶液，避光密封保存，在0h、4h、8h、12h、24h时分别测定凝集活性，RSD=5.8%，发现供试品溶液24h内凝集活性在避光密封保存条件下具有良好的稳定性。

3.2.2 重复性 将6份供试品溶液分别制备出来，RSD=7.0%，表明该方法具有良好的重复性。

3.2.3 中间精密度 为了对改变实验室内部条件影响测定结果的情况进行考察，相同实验室不同实验人员与不同工作日的RSD=9.9%，表明不同实验人员之间具有良好的中间精密度，该方法具有良好的日间精密度。

3.2.4 重现性 多个实验室对同一样品具有较小的测定结果变异，RSD=7.9%，表明方法具有良好的重现性。

3.3 板蓝根红细胞凝集活性和其抗病毒药理作用的相关性验证 检测20批板蓝根药材的红细胞凝集活性，并检测其对流感病毒NA活性的抑制作用，进行相关分析，发现板蓝根红细胞凝集效价和其抑制流感病毒NA活性之间相关性显著（r=0.83，P＜0.01），两种测定方法的结果具有较为一致的变化趋势。检测板蓝根红细胞凝集活性能够和板蓝根抗流感病毒的药理作用较好关联。

4 讨论

板蓝根的主要药效作用为抗病毒，鸡胚培养法及临床试验等均证实，红细胞凝集活性和其抗病毒作用呈显著的正相关关系[5]。本研究结果表明，板蓝根和阳性对照药对红细胞的凝集活性均显著。供试品溶液24h内凝集活性在避光密封保存条件下具有良好的稳定性。方法具有良好的重复性、日间精密度以及良好的重现性。板蓝根红细胞凝集效价和其抑制流感病毒NA活性之间相关性显著（r=0.83，P＜0.01），两种测定方法的结果具有较为一致的变化趋势。板蓝根红细胞凝集活性检测与板蓝根抗流感病毒的药理作用有较强的相关性，说明板蓝根基于红细胞凝集活性测定的质量生物鉴定方法能够对现行板蓝根质量控制水平进行补充与完善，同时也为缺乏合适化学检测指标的中药质量控制提供思路与技术支持。

从理论上来说，如果药理学方法可量化，那么其就能够在检测中药生物活性中应用，但是鸡胚培养法、细胞保护实验等抗病毒药理实验在定量化、安全性、可操作性等方面很难使药品检定的要求得到有效满足[6]。本研究所建立的板蓝根凝集活性测定方法具备定量、简便易行等优势，在控制板蓝根质量、评价其品质过程中具有一定优势与可行性。中药品质鉴定的生物测定方法的补充、完善提高了现有的中药质量，且并没有取代现有方法。如果中药品种缺乏清晰的药效成分与适宜的化学测定指标，那么就应该将生物测定的方法重点发展起来。如果中药品种能够将化学成分阐明，化学指标能够关联药效，那么可以采用以化学测定为主的质控方式。针对不同中药采取具有不同侧重点的常规检测+生物测定+化学测定三位一体的方法与模式，从而共同为中药质量把关。

综上所述，研究中所建立的方法和板蓝根抗流感病毒的药效相关，进而可区分与评价不同样品的品质，适用性较好，值得推广。