实时荧光PCR检测驼乳营养粉中蛋白的源性成分

刘德，章洁，占忠旭，张玥琦，朱应飞

江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院（南昌 330000）

骆驼乳具有较高的营养价值和药用价值，它富含蛋白质、矿物质和维生素，同时还具有抗微生物、抗氧化剂、抗病毒和抗癌等治疗特性，此外骆乳还可以添加到其他产品中制成增值产品[1-2]。驼乳营养粉是其制成增值产品的一种，它是以糖、乳及乳制品，适量添加驼乳和其他辅料制成的固体饮料[3]。随着人们生活节奏的加快和对医疗保健方面的重视，营养粉的消费需求日益增长[4]，驼乳营养粉因其方便冲泡、口感清爽香甜且营养丰富，已经成为人们经常消费的食品之一[1]。但是由于骆驼乳产量不仅受骆驼饲料转化方面的影响，还跟骆驼泌乳期和独特的气候天气息息相关，导致骆驼乳主要是在干旱或半干旱地区生产[5-7]，而高昂的人力、运输和储藏成本，使得目前骆驼乳价格是牛乳的8～10倍[8]。营养粉中会添加多种蛋白粉[9]，而不同的源性成分的蛋白粉具有相似的口感和化学成分[10-11]，难免有不法商家会虚假宣传、以次充好从中牟取暴利。实时荧光PCR技术通过检测不同物种的特异性保守序列，已有报道可应用于蛋白粉中源性成分的鉴定[12-13]。文章利用实时荧光PCR技术对23个驼乳营养粉样本分别检测骆驼、牛、羊、大豆源性成分，判断其质量状况及其标签真实性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

驼乳营养粉，随机采购23批不同商家的驼乳营养粉样品见表2。无水乙醇（纯度≥99.7%，国药集团化学试剂有限公司）；广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]；骆驼源性成分核酸检测试剂盒、羊源性成分核酸检测试剂盒、牛源性成分核酸检测试剂盒、大豆源性成分核酸检测试剂盒（广州双螺旋基因技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

CFX 96 Touch实时荧光PCR检测仪（BIO-RAD公司）；Multifuge X 1 R冷冻高速离心机（Thermo Fisher Scientific公司）；ScanDrop 100核酸蛋白测定仪（Analytik Jena公司）；Vortex Wizard涡旋震荡仪（Velp Scientifica公司）；Practum 224-1 CN电子天平（Sartorius公司）；MINIB-100金属浴恒温器（北京智云达科技股份有限公司）。

1.3 试验方法

骆驼源性成分、牛源性成分、羊源性成分参考GB/T 38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法》[14]，大豆源性成分参考BJS 201707《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》[15]，结合试剂盒进行测定，每次试验分别设置阴性对照、阳性对照、空白对照、内参基因，样品和对照设置2个平行反应体系。引物和探针序列见表1。

表1 引物和探针序列

1.3.1 DNA提取与纯化

称取50 mg驼乳营养粉置于2 mL离心管中，按照DNA提取试剂盒说明书步骤提取DNA，DNA提取质量用核酸蛋白测定仪（A260/A280）检测。

1.3.2 PCR扩增反应

反应试剂解冻后，每PCR管中加入20 μL反应液，再加入5 μL各样品DNA模板，盖好管盖，涡旋混匀30 s，离心1 min，确认各管无气泡后放入实时荧光PCR仪中，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择MGB。反应条件：去污染37 ℃ 10 min，预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 15 s，退火延伸60 ℃ 60 s（收集荧光信号），40个循环。

2 结果与分析

DNA提取液A260/A280的值均在1.6～1.8范围内，质量浓度为10～200 ng/μL，表明DNA模板的纯度和浓度均符合后续PCR的要求。

23份样品DNA模板按照1.3.2小节方法进行骆驼、牛、羊、大豆源性成分的PCR扩增反应，扩增曲线见图1～图4。阈值基线设置为阳性对照荧光强度的1/50，当荧光强度达到阈值时的扩增循环数即为Ct值。Ct值≤35.0，判定为阳性；Ct值≥40.0，判定为阴性。此次试验阳性对照Ct值均小于20.0，阳性样品Ct值均小于35.0，符合判定要求。如表2所示，驼乳营养粉标签成分均标称含驼乳粉、全脂乳粉，部分标称含有大豆蛋白粉。23个样品中，检出骆驼源性成分的为1个，占总数的4.3%，检出牛源性成分的为23个，占总数的100%，检出羊源性成分的为0个，占总数的0，检出大豆源性成分的为13个，占总数的56.5%。

图1 骆驼源性成分检测

图2 牛源性成分检测

图3 羊源性成分检测

图4 大豆源性成分检测

表2 驼乳营养粉检测结果

3 结论与讨论

驼乳营养粉属于固体饮料，侧重饮料工艺，奶粉含量较低。虽然所有样品标签都标明添加了驼乳粉，但是添加量存在较大差异，添加量最多的为10%，最少的仅为0.5%。表明驼乳营养粉质量良莠不齐。虽然驼乳粉添加量较少的样品分离后的DNA产量较低，但通过实时荧光PCR扩增，分离出的DNA片段很容易被特异性识别[13]，本次试验方法参考标准配合试剂盒使用，检出限为0.1%[14-15]。从试验结果可以看出：多数生产驼乳营养粉的企业没有严格按照标签值添加驼乳粉；企业在蛋白的源性成分选择上，所有的企业都添加了牛乳粉，部分企业添加了大豆蛋白粉，没有企业添加羊乳粉，造成这一现在主要原因可能是牛乳粉和大豆蛋白粉价格低廉，驼乳粉和羊乳粉价格相对较贵造成的[8]。

此次试验利用PCR技术来检测驼乳营养粉中蛋白源性成分，特异性和灵敏度较好，可为驼乳营养粉的监督抽检及产品标准的修订提供参考依据。大致了解了驼乳营养粉中蛋白源性成分的组成及含量，也能更好的维护消费者的合法权益，促进驼乳营养粉产业健康发展。