婴幼儿配方乳粉中生物素的测定能力验证结果分析

阴甜甜，张璐，张莹莹，李轲

1. 河南德仕人力资源服务有限公司（郑州 450003）；2. 郑州海关技术中心（郑州 450003）

生物素（Biotin）又被称为维生素B7、维生素H、辅酶R（Coenzyme R）等，是一种人体无法自身合成、机体机能所必需的水溶性B族维生素，长期缺乏会导致一系列的缺乏症，常以皮肤、黏膜和神经系统损害为主[1-2]。尤其是婴幼儿肠道功能较弱，缺乏生物素容易患皮炎、舌炎，甚至引起严重的神经症状，所以，常在婴幼儿食品中添加生物素[3]。我国对食品标签有严格规定，标准中要求在产品有效期内，营养成分与能量的实际含量要高于标示值的80%[4]。生物素作为婴幼儿乳粉中重要添加物质，是我国重点监管对象。

能力验证是指借助实验室之间的对比判断其检测、校准等能力，是判断和监控实验室技术能力、改进质量管理体系的有效手段，是重要的实验室外部质量控制方法[5]。通过能力验证可以让各个实验室发现自身存在的问题，对实验室人员能力的评价、数据与结果准确性的评价、方法的验证等都有很大意义。CNAS-RL02：2018《能力验证规则》中规定：食品微生物领域的能力验证最低参加频次为1次/年以上[6]。

为检测实验室是否掌握配方乳粉中生物素的检测能力，实验室参加市场监管总局组织的婴幼儿配方乳粉中生物素的测定检测能力验证活动。实验室严格按照GB 5009.259—2016《食品安全国家标准 食品中生物素的测定》[7]，对配方乳粉中生物素含量进行检测。通过对能力验证的测定过程及结果进行总结分析，为后期检测工作的开展提供依据和思路。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品NLYZ-YP-058和NLYZ-YP-109（样品基质为婴幼儿配方乳粉，铝箔纸密封袋包装，河北省食品检验研究院）。

1.2 试剂耗材

生物素检测国标即用型套装（北京陆桥技术股份有限公司）；硫酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；氢氧化钠（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；实验室用水均为无菌水。

1.3 仪器与设备

INE 500型恒温培养箱（德国Memmert公司）；Cary 60型紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司）；ME 203型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；PB-21型PH计（德国赛多利斯公司）；HVA-85型高压灭菌锅（日本HIRAYAMA公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理

按照GB 5009.259—2016[7]中6.2.2的要求对2份样品进行相应处理，并进一步稀释。

1.4.2 培养基和标准溶液制备（无菌操作）

按照生物素检测国标即用型套装试剂盒说明书进行培养基、生物素标准溶液和生物素标准工作液的制备。

1.4.3 标准系列管制备

取无菌试管按表1顺序加入各成分，制作标准曲线管，1式3份。

表1 标准系列管制作 单位：mL

1.4.4 试样系列管制备

将制备好的样品稀释液使用无菌滤膜（0.22 μm）过滤，按GB 5009.259—2016[7]中6.4.1的要求加入无菌水、无菌样品溶液和生物素培养基于无菌试管中，混匀。每个梯度做3个平行。

1.4.5 培养

于37 ℃恒温培养箱中避光培养44～48 h至获得最大浑浊度。

1.4.6 测定

将培养好的标准系列管、试样系列管涡旋混匀，使用紫外可见分光光度计于波长550 nm处测定标准系列管、试样系列管吸光度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

采用Excel以标准系列生物素含量与吸光度进行线性回归分析，得到线性拟合曲线，如图1所示。线性回归方程的相关系数R2=0.990 1，生物素标准曲线线性关系良好。

图1 生物素标准曲线

2.2 结果计算

按GB 5009.259—2016[7]中6.7.2的要求进行结果计算，具体结果见表2，精密度分别为0.40%和0.73%，结果有效。综合结果进行上报，样品NLYZ-YP-058生物素含量为22.4 μg/100 g，样品NLYZ-YP-109生物素含量为34.1 μg/100 g。结果反馈Z值分别为0.30和0.52，均小于2.0，结果评价均为满意，表明该项目实验室检测能力无偏倚。

表2 样品测定结果

3 分析与讨论

生物素的检测方法众多，主要有微生物法、高效液相色谱法、酶联免疫法、生物传感器法、荧光免疫层析法等，但每一种检测方法各具优缺点，各有其适用范围[8-15]。其中，微生物法测定的生物素是有生物活性的，反映食品中能被人体吸收利用的生物素含量，并且具有灵敏度高、检测限低、可靠性强、成本较低、适用范围广等优点[8]。但该法检测生物素前处理复杂，操作步骤繁琐，对试验器皿和试验人员操作技术要求较高，且耗时较长，要确保检测数据准确可从几方面进行分析，并及时改进[2,16-17]。

3.1 人员

在微生物试验中，检测人员的检测技能、关键点掌握、操作熟练度等都对检测结果准确性有重要影响，因此，检测人员必须具有夯实的业务能力、熟练的操作技术，实事求是、严谨认真的工作态度，能正确理解标准，规范实施检测[18]。GB 5009.259—2016方法对于很多细节有很高的要求，这就要求检测人员有一定的检测经验积累。因此，在能力验证时，主检人员要责任心强、操作经验丰富、分析和解决问题能力强[19]。

3.2 玻璃器皿处理

在测定过程中，生物素易与抗生素因子结合，污染概率高于泛酸等其他维生素，且油脂会促进植物乳杆菌的生长[17,20]。因此，生物素检测试验所有用品要专用，不与其他试验混合使用，此外，试验过程中用到的所有玻璃器皿要严格处理，使用前用一定浓度盐酸漂洗，用蒸馏水清洗干净后170 ℃烘烤3 h，从而去除残留的微量生长因子。同时，严格清理检测场所，确保无菌洁净[17,20-21]。

3.3 菌株制备

试验菌株是维生素试验的关键，因此，必须严格控制菌种的保存和转种，使用前连续传代3次以增强菌种活力，提高菌种对生物素的敏感性。此外，有研究表明，利用甘油在超低温条件下冻存处于对数期生长的测试菌种，取出后可直接用于测定中，菌种活性强，测定效果较好，大幅提高实际工作中试验的效率[22-23]。在能力验证中所使用的检测菌株是试剂盒自带的冻干菌球，取得较好的试验结果，因此，各实验室可根据实际需要选择合适的菌株制备方法。

3.4 试样制备

试样前处理是影响测定结果准确性的另一关键因素，所以应严格按照标准要求进行试样前处理。GB 5009.259—2016对婴幼儿配方食品中生物素采用3%（约0.5 mol/L）硫酸进行提取，且随着硫酸溶液浓度的提高，生物素的含量会下降[24-25]。试样水解后降温过程要迅速，避免发生颜色变化。试样稀释后的生物素浓度（一般通过样品标签标示值获得）应尽量被标准溶液的系列梯度所覆盖，必要时可多选几个稀释度[21]。同时试样处理时，需要用氢氧化钠溶液调节pH，需注意如果调过头，用H2SO4调回，不能用HCl，因为HCl会使生物素失去活性[20]。

3.5 标准系列管制备

为避免交叉污染，在制备标准系列管时要使用专用的器皿，同时建议按照添加水—培养基—盖上空白管的试管帽—标液和样品稀释液的顺序进行操作，标准品、样品检测3次[21]。

3.6 培养和测定

所有试管均避光培养直至获得最大浑浊度，混匀后测定吸光度。国标检测都采用紫外分光光度计来测定培养物的吸光度，为保证仪器设备工作状态良好，应按照国家相关法律法规的要求对仪器进行检定、校准或期间核查，并定期进行维护和性能验证，做好相关记录，以减小仪器带来的误差并方便溯源，若仪器设备被检修，恢复使用前应对其进行检查或校准，以保证性能符合检测要求。

3.7 结果分析

在标准曲线拟合过程中，各个点并不是严格分布在直线上，这是因为微生物生长过程中会受到竞争与抑制作用，随着生物素浓度的增加，吸光度增长趋缓，所以，通常情况下标准曲线相关系数大于0.95就可以接受[21]。

4 结论

能力验证采用国标方法对婴幼儿配方乳粉中的生物素进行测定，取得满意结果，这离不开实验室检测人员仔细阅读作业指导书、规范操作、对试剂等做好质控等。通过能力验证，实验室检测能力、人员专业技术能力、职业素养等都有了很大提升。

能力验证不仅可以客观地衡量实验室检测能力和管理水平，也是实验室内外部质控的有效手段。实验室通过参加能力验证活动，可以全面了解实验室的检测能力，还可以及时发现存在问题，也为后期开展食品检验检测工作实施提供对照依据和新思路。