油茶果壳黄酮、多酚纯化技术及抗氧化活性研究

郭永生，吴静，吴磊，顾震，谢传奇，熊伟

江西省科学院应用化学研究所（南昌 330096）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是中国特有的木本油料，在我国江西、湖南、福建等地广泛种植。近些年国内油茶发展迅速，朝着万亿级别产业迈进[1]。油茶果壳作为油茶加工过程的副产物，据统计国内每年有超过300万 t的产量，而油茶果壳大多作为初级燃料和培养食用菌，不但没有得到充分加工利用，而且会对空气、水体和生态造成污染[2-3]。有研究表明，油茶果壳提取物具有一定抗氧化能力，如：彭玲[4]研究表明油茶壳黄酮粗提物对食用油脂的氧化有一定延缓作用；李利敏等[5]研究表明油茶蒲提取物具有较强清除DPPH自由基能力，并发现油茶蒲提取物抗氧化能力与其多酚及多糖类物质含量具有显著相关性。此外也有研究对油茶果壳中的抗氧化成分如黄酮、多酚等成分进行优化提取，如Zhang等[6]采用微波辅助提取，以水为提取溶剂优化提取油茶壳中多酚，多酚得率达15.05%，且酚类提取物中以没食子酸为主。对果壳中的研究主要集中在活性物质的提取上，但获得的粗提物中含有较多杂质，需要进一步纯化。大孔树脂以其吸附性能好、吸附效率高、再生简便、成本低等优点，因而被广泛应用于天然产物的富集和分离[7]。

油茶果壳中黄酮类和多酚物质虽含量低，但来源丰富，成本低，且具有较好的应用前景和社会效益。因此以油茶果壳为原料，采用D101型大孔树脂按照不同浓度梯度的乙醇对油茶果壳乙醇提取物进行洗脱纯化，对洗脱纯化得到的各个部分进行总黄酮和总酚含量的测定，通过ABTS+自由基、DPPH自由基清除试验及铁离子还原试验等方法评价其各部分的抗氧化活性，以期丰富油茶果壳开发和利用的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦丁标准品（上海盈元化工有限公司）；没食子酸标准品（麦克林公司）；油茶果壳（江西恩泉油脂有限公司）；抗坏血酸（分析纯，上海盈元化工有限公司）；三氯化铁（分析纯，阿拉丁公司）；铁氰化钾（分析纯，阿拉丁公司）。

JHBE-100A闪氏提取器（智晶生物有限公司）；R-1020旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；FDU-1200冷冻干燥机（上海爱朗仪器有限公司）；M200PRO酶标仪（上海精宏实验设备有限公司）；YC-1800低温喷雾干燥机（上海雅程仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 油茶果壳粗提物的备制

称取油茶果壳置于闪氏提取器粉碎，按1∶20 g/mL的料液比加入70%乙醇-水溶液超声（400 W，40 min）重复提取2次，静置后取上清液进行抽滤，进行减压浓缩，转入实验室低温喷雾干燥机在150 ℃进行喷雾干燥。

1.2.2 油茶果壳提取物的纯化

树脂预处理方法：参考邹苏兰等[8]的方法，将50 g D101大孔吸附树脂用300 mL无水乙醇浸泡24 h充分溶胀后，用95%乙醇冲洗，至洗出液加5倍量蒸馏水时无白色浑浊，蒸馏水洗至无醇味，密封保存备用。

将活化的大孔树脂装柱，取10 g油茶果壳粗提取物上样，静置吸附一晚，依次用0，10%，30%，50%，70%和100%的乙醇-水溶液进行洗脱，洗脱至无色，分别收集流出液，进行减压浓缩、冷冻干燥，得到各洗脱部分物质。

1.2.3 总黄酮的测定

参照李少泓[9]的总黄酮含量测定方法，并作适当改动。吸取1 mL样品（1 mg/mL）或芦丁标样，加入0.3 mL 5%的亚硝酸钠溶液摇匀，常温静置5 min。依次加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液和2 mL 4%氢氧化钠溶液，混匀，常温静置15 min，在波长510 nm处测定吸光度，测定结果以每克样品中总黄酮含量（芦丁计）表示，mg/g。

1.2.4 多酚含量的测定

参照申元福等[10]的方法，并做适当改动。吸取1 mL样品（1 mg/mL）或没食子酸标准溶液，依次加入1 mL超纯水和0.2 mL福林酚试剂，充分混匀后静置3 min后，加入0.6 mL 7.5%的碳酸钠溶液，再次充分混匀，在室温下静置40 min，取上清液，用酶标仪在765 nm波长处测定吸光度。测定结果以每克样品中总多酚含量（以没食子酸计）表示，mg/g。

1.2.5 油茶果壳提取物体外抗氧化活性研究

1.2.5.1 溶液的配制

分别称取对照品VC、粗提物及各洗脱部分样品，用甲醇溶解配制1 mg/mL的母液，用甲醇将母液稀释至不同倍数，配制质量浓度800.00，400.00，200.00，100.00，50.00，25.00，12.50和6.25 μg/mL的样品溶液。

1.2.5.2 Fe3+还原能力测定

参考陆永旺等[11]的方法，采用普鲁士蓝法测定样品还原Fe3+能力。取200 μL待测溶液，依次加入500 μL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和500 μL 1%氰化钾溶液，摇匀后放入50 ℃恒温水浴锅中30 min，取出迅速放入冰水中冷却，加入500 μL 10%三氯乙酸溶液，摇匀、静置5 min，取500 μL上清液，依次加入500 μL超纯水和100 μL 0.1%三氯化铁溶液，摇匀后静置10 min，吸取200 μL至96孔板中，于波长700 nm处测吸光度。每个样品平行测定3次。

参考多肽抗氧化性测定DPPH和ABTS法[12]，进行适当改动，通过与VC的清除能力作比较，来判定提取物的抗氧化能力。

1.2.5.3 DPPH自由基清除

取100 μL不同浓度的标准品溶液和标准品溶液于96孔板中，加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液。混合均匀后于常温避光反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度，每个样品平行测定3次。VC溶液作为阳性对照组样品溶液，甲醇溶液作为空白对照组样品溶液。DPPH清除率按式（1）计算。

式中：A1为空白对照组吸光度；A2为样品组吸光度。

1.2.5.4 ABTS+自由基清除

溶液配制完成之后，吸取50 μL待测液溶液与150 μL ABTS+溶液于96孔板中，混合均匀后于常温下避光反应30 min，在波长734 nm处测定吸光度。阳性对照组的样品溶液用VC溶液替代，空白对照组的样品溶液用甲醇溶液替代，ABTS+清除率按式（2）计算。

式中：A1为空白对照组吸光度；A2为样品组吸光度。

2 结果与分析

2.1 各洗脱部分总黄酮、总多酚含量的测定

由图1可知，各洗脱部分中总黄酮和多酚含量有明显差异，其中：总黄酮含量的排序为10%洗脱部分＞30%洗脱部分＞粗提物＞50%洗脱部分＞0%洗脱部分＞70%洗脱部分＞100%洗脱部分；总多酚含量的排序为10%洗脱部分＞30%洗脱部分＞粗提物＞50%洗脱部分＞0%洗脱部分＞70%洗脱部分＞100%洗脱部分。10%乙醇-水和30%乙醇-水洗脱部分的总黄酮和多酚含量较初提物有明显的提高，其中以10%洗脱部分的总黄酮及总多酚含量最高，分别为648.74和572.48 mg/g，较初提物中含量分别提高2.0和1.8倍，富集效果明显。但由于油茶壳中含有较高的棕色素[13]，在溶解粗提取及洗脱部分时有一定颜色及含有类黄酮化合物[14]，可能导致黄酮含量的结果有一定误差。对比白杨[15]经复配树脂纯化后多酚纯度可达71.73%，可能由于试验中使用的大孔树脂没有经过复配，纯化效果不能达到最优。

结合各洗脱部分产物质量，计算总部分的总黄酮及多酚的得率，具体如表1所示。

表1 各洗脱部分总黄酮和总多酚的得率

由表1可以看出，30%乙醇-水洗脱部分中的总黄酮和总多酚的提取效率最高，分别是43.84%和28.52%，其次是10%乙醇-水洗脱部分，因此对于工业提纯来讲可以参考该范围的洗脱溶液。沈福建等[16]通过正交试验得出，油茶果壳黄酮溶出量为1.709%，试验只达到1.3%，这是因为试验为适应工业化生产，只是经过简单的醇提及油茶果壳品种的不同造成溶出率有差异。

2.2 各洗脱部分抗氧化能力测定

选择Fe3+还原能力测定对各洗脱部分的抗氧化能力进行研究，对Fe3+还原能力越强，吸光度越高，抗氧化活性越强。具体结果如图2所示。

图2 各洗脱部分Fe3+还原试验结果

结果表明，油茶果壳粗提物、各洗脱部分还原Fe3+的能力和浓度都存在一定关系，随着质量浓度升高，其还原能力也随之增加。在相同质量浓度下，各洗脱部分的抗氧化能力均弱于VC。其中，在各洗脱部分中，抗氧化能力效果最强的是10%乙醇-水洗脱部分，其次为30%乙醇-水洗脱部分，与多酚及总黄酮的含量保持一致，且较初提物有明显提高。

还原能力测定结果表明各洗脱部分能够向自由基提供质子表现出抗氧化能力，因此试验进一步利用DPPH自由基和ABTS+自由基清除试验，探究各部分的抗氧化剂活性是否通过电子转移途径实现清除自由基，自由基清除试验结果如图3和图4所示。

图3 各洗脱部分DPPH自由基清除试验结果

图4 各洗脱部分ABTS+自由基清除试验结果

结果表明，油茶果壳粗提物、各洗脱部分清除DPPH自由基和ABTS+自由基的效果和浓度都存在一定关系，随着质量浓度的升高，其清除率也随之增加，和还原能力测试结果保持一致，说明其抗氧化活性可能通过电子转移途径实现清除自由基，可能与黄酮及多酚清除自由基能力实现途径保持一致[16]。

洗脱部分的自由基清除能力大小为10%洗脱部分＞30%洗脱部分＞粗提物＞50%洗脱部分＞0%洗脱部分＞70%洗脱部分＞100%洗脱部分。低浓度（0～25 mg/mL）时，各洗脱组分的自由基清除能力弱于同浓度VC，但高浓度（＞25 mg/mL）时，10%洗脱部分及30%洗脱部分清除自由基能力接近同浓度的VC。

对比可以发现，相较于ABTS+自由基清除能力，各洗脱部分的DPPH自由基清除能力随着浓度的增加有明显的降低，可能与ABTS+自由基在水与醇溶液中有良好的溶解性，而DPPH自由基是醇溶性自由基有关[17]。可能洗脱部分带有部分的水溶性抗氧化剂，随着浓度的增加而引起差异。

3 结论

通过结果数据比较分析各洗脱部分和粗提物的总黄酮含量、多酚含量，以及DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和还原Fe3+能力，试验表明：10%乙醇-水洗脱纯化效果明显，其总黄酮和多酚含量分别为648.7和572.5 mg/g，较粗提物含量提高2.1倍和1.8倍；结合各洗脱部分，以30%乙醇-水溶液的总黄酮和总多酚提取效率最高，分别达到43.84%和28.52%；通过还原能力及自由基清除试验发现，10%乙醇-水洗脱部分抗氧化能力最优，其次为30%乙醇-水溶液，且其抗氧化活性可能通过电子转移途径实现清除自由基。

综上，通过简单的乙醇-水洗脱工艺可有效富集油茶果壳初提物中的多酚及黄酮成分，同时提高抗氧化能力，为工业提取油茶果壳黄酮、多酚提供参考意见，进一步丰富油茶果壳开发和利用的理论基础。