臭氧处理对采后杏果实活性氧代谢的影响

芦玉佳，李 玲，张亚琳，张文娜，马海娟，朱 璇

（新疆农业大学食品科学与药学学院 乌鲁木齐 830052）

杏（Prunus armeniacaL.）属蔷薇科李属植物[1]，普遍种植于温带地区，具有很高的营养价值。新疆是杏的重要栽培中心，其特殊的自然环境使杏果实具有品质优良，含糖量高，果肉多汁等特点[2]。杏是呼吸跃变型果实，采后生理代谢旺盛，后熟快。在贮运时，杏果实易受到病原微生物的侵染，从而发生腐烂，造成大量损失[3]。寻找安全、有效的采后果蔬贮藏保鲜方法，已成为亟待解决的重要问题。

臭氧是一种活性高，渗透性强，无残留的强氧化剂，具有延缓果蔬后熟，抑制品质下降等特点[4]。在采后果蔬的研究中发现，臭氧处理可以保持草莓[5]、桑葚[6]等果蔬的品质，延长贮藏时间。臭氧处理是目前果蔬贮藏最为有效的物理保鲜技术之一，其对真菌、细菌等有强烈的直接杀灭作用[7]。Luo 等[8]在对猕猴桃的研究中证实臭氧能抑制灰霉孢子的萌发及菌丝发育，显著降低发病率。冷藏期间将柑橘暴露在富含臭氧的环境中，可显著抑制意大利青霉（Penicillium italicum）的正常生长[9]。

臭氧除了直接的杀菌作用，还能通过诱导果实防御反应来抵抗外界病原菌的侵染，臭氧处理能有效激活抗氧化防御系统，提高树莓的抗氧化能力，从而提高果实的抗病性[10]。Ioannis 等[11]研究表明臭氧可增加猕猴桃总酚类黄酮的含量，显著提高抗氧化活性，从而减少冷藏过程中猕猴桃的发病率。在对番茄[12]的研究中也发现，臭氧通过诱导植物分泌植保素如白藜芦醇等，降低果实的腐烂率。

目前臭氧处理主要集中在通过直接杀菌作用延缓果实腐烂及保持其品质等方面的研究，然而通过调控活性氧代谢与增强果蔬抗病性关系的研究鲜见报道。本试验采用臭氧处理杏果实，研究臭氧处理对杏果实自然发病率及活性氧相关酶活性的影响，探究臭氧处理诱导杏果实抗病性的作用机理，为臭氧广泛应用于果蔬的贮藏提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

“赛买提”杏，采自新疆库车县乌恰镇，选取可溶性固形物为12.0%～13.0%，硬度为（18.0±0.5）N，无机械伤、无腐烂、个体均一的果实作为试验用果，当天运回实验室，于5 ℃预冷24 h。

1.2 试剂与仪器

聚乙烯吡咯烷酮、α-萘胺、冰醋酸、浓氨水、硫酸、盐酸、丙酮、氮蓝四唑、三氯乙酸、无水醋酸钠、愈创木酚均为国产分析纯级。

试验主要仪器如表1 所示。

表1 试验主要仪器Table 1 Test main instrument

1.3 试验预处理

预试验结果表明预处理杏果实的臭氧最佳浓度为200 mg/m3，处理方法参照李玲等[13]的方法，将臭氧气体通入密封箱（70.0 L）中，箱内臭氧气体浓度达到200 mg/m3时，密闭处理30 min，对照组为密封箱不通入臭氧气体的杏果实。每隔7 d 处理一次，每组处理用果3.0 kg，试验重复3 次，熏蒸后置于冷库【温度（1.0±0.5）℃，RH 90%～95%】中低温贮藏49 d，每7 d 测定各项指标。

1.4 指标测定

1.4.1 自然发病率 定期统计贮藏期杏果实的自然发病情况，单个杏果实病斑直径达4.0 mm 以上计为发病果，统计结果用百分数表示[14]。

1.4.2 H2O2含量的测定 参照曹建康等[15]的方法，结果以μmol/g 表示。

1.4.3 超氧阴离子（O2-·）产生速率的测定 参照Li 等[16]的方法，单位为nmol/min·g。

1.4.4 ROS 清除酶活性测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定参照吴媛媛等[17]的方法，抗坏血酸过氧化物酶（APX）测定参照曹建康等[15]的方法，超氧化物歧化酶（SOD）测定参照黄余年等[18]的方法，过氧化物酶（POD）活性测定参照王星星等[19]的方法。

1.4.5 丙二醛含量的测定 参照Shan 等[20]的方法，单位为μmol/g。

1.4.6 细胞膜渗透率的测定 参照曹建康等[15]的方法，采用电导率法，结果用百分数表示。

1.5 数据分析

采用SPSS 26.0 软件，利用t 检验进行差异显著性分析，P＜0.05 表示差异显著，采用Origin 2020 软件作图。

2 结果与分析

2.1 臭氧处理对杏果实自然发病率的影响

由图1 可知，杏果实的自然发病率在贮藏期间呈上升趋势，且200 mg/m3臭氧处理组杏果实自然发病率显著低于对照组（P＜0.05）。在第14 天时，对照组杏果实已发病，而臭氧处理组的杏果实在21 d 才开始发病，到35 d 时，200 mg/m3臭氧处理组杏果实的自然发病率为7.67%，比对照组低72.28%（P＜0.05）。在贮藏结束时，臭氧组自然发病率比对照组低61.94%（P＜0.05）。结果表明，200 mg/m3臭氧处理能显著降低杏果实的自然发病率并有效推迟发病时间。

图1 臭氧处理对杏果实自然发病率的影响Fig.1 Effects of ozone on disease incidence of apricot fruit

2.2 臭氧处理对杏果实H2O2 含量的影响

活性氧产生的H2O2可以直接攻击病原菌，抑制病原微生物发育，另一方面，H2O2还能调控植物防御系统[21]。如图2 所示，贮藏前期（0～21 d），臭氧处理组H2O2迅速积累，14 d 时达到峰值。贮藏后期，臭氧诱导CAT 酶活性升高，H2O2含量逐渐下降，到28 d 时，对照组杏果实H2O2含量比200 mg/m3臭氧处理组高14.54%（P＜0.05）。第42 天时，臭氧处理组杏果实H2O2含量仅为26.59 μmol/g，比对照组低21.20%（P＜0.05），贮藏结束时，对照组H2O2含量是臭氧处理组的1.26 倍（P＜0.05）。

图2 臭氧处理对杏果实过氧化氢含量的影响Fig.2 Effects of ozone treatment on H2O2 content of apricot fruit

2.3 臭氧处理对杏果实CAT 活性的影响

从图3 可以看出，随贮藏期间的延长，臭氧处理组杏果实的CAT 活性先略下降后升高，在第35天上升至峰值。对照组杏果实的CAT 活性在7 d达到峰值，是处理组的2.43 倍（P＜0.05），贮藏后期（21～49 d），对照组杏果实的CAT 活性开始逐渐下降。200 mg/m3臭氧处理组的CAT 活性在第35 天达到最大值（113 U），是对照组的2.0 倍（P＜0.05），贮藏第49 天时，臭氧组杏果实的CAT 活性比对照组高48.43%（P＜0.05）。结果表明，200 mg/m3臭氧处理的杏果实能保持较高的CAT 活性。

图3 臭氧处理对杏果实CAT 活性的影响Fig.3 Effects of ozone treatment on CAT activity of apricot fruit

2.4 臭氧处理对杏果实超氧阴离子产生速率的影响

如图4 所示，杏果实的O2-·在贮藏前期（0～28 d）急速增加。与对照组相比，臭氧处理组显著抑制了贮藏期间果实中O2-·的上升（P＜0.05）。第14 天时，对照组的O2-·产生速率是臭氧处理组的1.41倍（P＜0.05），到28 d 时，两组杏果实的O2-·产生速率均达到峰值，200 mg/m3臭氧处理组的O2-·产生速率为1 220 nmol/min·g，比对照组低17.3%（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，O2-·产生速率逐渐下降，而200 mg/m3臭氧处理组O2-·产生速率始终低于对照组，贮藏结束时，对照组O2-·产生速率是臭氧处理组的1.58 倍（P＜0.05），说明臭氧处理能够显著延缓杏果实O2-·的产生速率。

图4 臭氧处理对杏果实O2-·产生速率的影响Fig.4 Effect of ozone treatment on O2-·production rate of apricot fruit

2.5 臭氧处理对杏果实SOD 活性的影响

由图5 可知，200 mg/m3臭氧处理组SOD 活性在杏果实贮藏期间均高于对照组。贮藏前期（0～28 d），两组SOD 活性呈上升趋势。到7 d 时，臭氧处理组杏果实SOD 活性比对照组高20.09%（P＜0.05），在第28 天时，臭氧处理组杏果实SOD 活性达到5.40 U，比对照组高22.81%（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，杏果实SOD 活性逐渐下降。在贮藏第49 天时，臭氧处理组SOD 活性为4.14 U，是对照组的1.14 倍（P＜0.05），上述结果表明臭氧处理能够有效提高杏果实的SOD 活性。

图5 臭氧处理对杏果实SOD 活性的影响Fig.5 Effect of ozone treatment on SOD activity of apricot fruit

2.6 臭氧处理对杏果实APX 活性的影响

由图6 可知，贮藏期间，与对照组相比，200 mg/m3臭氧处理能显著提高APX 活性（P＜0.05）。贮藏21 d 时，臭氧处理组的APX 活性为13.52 U，是对照组的1.37 倍（P＜0.05），在贮藏第35 天时，200 mg/m3臭氧处理杏果实的APX 活性达到峰值，此时臭氧处理组杏果实APX 活性是对照组的1.91 倍（P＜0.05）。贮藏后期（35～49 d），APX 活性逐渐降低，贮藏至49 d 时，臭氧处理组杏果实的APX 活性比对照组高57.49%（P＜0.05）。由此表明，臭氧处理能够有效提高贮藏期间杏果实的APX 活性。

图6 臭氧处理对杏果实APX 活性的影响Fig.6 Effects of ozone treatment on APX activity of apricot fruit

2.7 臭氧处理对杏果实POD 活性的影响

由图7 可知，在杏果实贮藏期间，200 mg/m3臭氧处理组POD 活性均高于对照组。从开始贮藏至贮藏21 d，臭氧处理组杏果实POD 活性上升迅速，到14 d 时，臭氧处理组杏果实的POD 活性比对照组高11.24%（P＜0.05）。贮藏28 d 时，臭氧处理组POD 活性是对照组的1.06 倍，差异显著（P＜0.05），贮藏结束时，臭氧处理组的POD 活性为1.98 U，比对照组高14.98%（P＜0.05）。由此说明臭氧处理提高了贮藏过程中杏果实的POD 活性。

图7 臭氧处理对杏果实POD 活性的影响Fig.7 Effects of ozone treatment on POD activity of apricot fruit

2.8 臭氧处理对杏果实MDA 含量的影响

MDA 是膜脂过氧化的产物，其含量表明果蔬细胞受胁迫的程度[22]。由图8 可知，在杏果实贮藏过程中，杏果实的MDA 含量不断增加，200 mg/m3臭氧处理组的MDA 含量显著低于对照组（P＜0.05）。贮藏前期（0～14 d），对照组杏果实的MDA含量变化较大，上升迅速，在贮藏14 d 时，对照组的MDA 含量是处理组的1.40 倍（P＜0.05）。到21 d 时，对照组MDA 含量为3.15 μmol/g，是处理组的1.36 倍（P＜0.05），贮藏后期，MDA 含量上升缓慢，在第49 天时，臭氧处理组MDA 含量比对照组低20.78%（P＜0.05）。结果表明臭氧处理可抑制杏果实贮藏期MDA 含量的上升。

图8 臭氧处理对杏果实MDA 含量的影响Fig.8 Effects of ozone treatment on MDA content of apricot fruit

2.9 臭氧处理对杏果实细胞膜渗透率的影响

由图9 可知，杏果实的细胞膜渗透率在贮藏期间逐渐上升，贮藏前期（0～21 d），两组杏果实细胞膜渗透率无显著差异。第7 天时，200 mg/m3臭氧处理组的细胞膜渗透率为24.53%，比对照组低8.16%，在贮藏28～49 d 时，臭氧处理抑制了细胞膜渗透率的升高，200 mg/m3臭氧处理组杏果实细胞膜渗透率显著低于对照组（P＜0.05）。在贮藏结束时，200 mg/m3臭氧处理杏果实的细胞膜渗透率为61.32%，对照组杏果实的细胞膜渗透率是臭氧组的1.37 倍（P＜0.05）。由此说明臭氧可有效抑制杏果实细胞膜渗透率的升高，保持细胞膜的完整性。

图9 臭氧处理对杏果实细胞膜渗透率的影响Fig.9 Effect of ozone treatment on cell membrane permeability of apricot fruit

3 讨论

臭氧是大气中的一种天然物质，具有很强的氧化能力和高效的杀菌作用，在空气中会逐渐分解成氧气，无残留[23]。臭氧处理具有直接杀菌作用，不仅可以抑制真菌孢子萌发与生长，降低果蔬自然发病率，还能清除农药残留[24]。Gabler 等[25]研究发现高浓度臭氧处理显著降低了葡萄果实灰霉菌的发病率，并减少4 种常用杀菌剂的残留量。袁乙平等[26]在对青梅的研究中发现，臭氧处理能显著抑制皮落青霉、米曲霉和日本曲霉的孢子萌发率，抑制产孢能力、菌丝生长量及菌落扩展。臭氧处理能导致互隔交链孢菌丝萎缩和孢子褶皱，抑制其生长，还能降解3 种交链孢毒素[27]。

活性氧是一类具有化学活性、氧化能力强的氧分子，主要包括O2-·和H2O2[28]。本试验结果表明，臭氧处理组早期H2O2含量显著高于对照组，较高的H2O2含量具有直接杀菌的作用并能作为信号分子刺激杏果实启动寄主的防御反应，对病原菌侵染做出抗病反应[29]。然而，H2O2和O2-·一直保持在较高水平会引起膜脂过氧化，造成细胞膜结构的破坏和功能丧失[30-31]。SOD、POD、CAT、APX是植物酶促防御系统的重要组成部分，他们协同作用以清除活性氧，避免过多活性氧累积对植物组织造成氧化胁迫[32-33]。从本试验结果可知，臭氧处理组的CAT、SOD、POD、APX 等抗氧化酶活性显著高于对照组，臭氧诱导杏果实体内活性氧清除系统中相关酶活性的增强，有效降低了杏果实体内积累的O2-·和H2O2的含量，使杏果实抗氧化系统平衡，降低细胞膜渗透率和MDA 含量，减缓膜脂过氧化程度。血橙[34]、树莓[35]、葡萄[36]的研究中也表明果蔬抗病性的增强与活性氧代谢和保持抗氧化系统的平衡有密切关系。

以上结果表明，臭氧不仅具有直接杀菌作用，而且通过调控活性氧代谢增强杏果实的抗病性，有效降低杏果实的发病率，延长贮藏期。

4 结论

综上所述，200 mg/m3臭氧处理能显著降低杏果实的自然发病率，提高APX、SOD、POD 和CAT酶的活性，减缓H2O2含量及O2-·的产生速率，抑制MDA 含量及细胞膜渗透率的上升，由此表明，臭氧可以通过调控活性氧代谢增强杏果实的抗病性。