茶树修剪老叶成分分析及利用塔宾曲霉制备茶褐素的条件优化

白 健，龚加顺，艾桄屹，王秋萍

（云南农业大学食品科学技术学院 昆明 650201）

大叶晒青茶是选用云南大叶种茶叶（Camellia sinesis Var.assamica），经过摊放、杀青、揉捻后，在日光下干燥的茶叶，是普洱生茶和熟茶的原料[1]，其中含有丰富的多酚类物质如黄酮、儿茶素和生物碱，如咖啡因等营养成分。多酚类化合物是其分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称[2]。研究较多的是儿茶素类中的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）单体，具有多种生物学功能，早在1987 年就有EGCG 抑制人体癌细胞作用的报道[3]。多酚类物质具有抗氧化，抗突变，降压，降血脂，降血糖[4-6]，抑制黑色素的合成[7]，保护肾脏、肝脏[8]等功能。

茶褐素是一类易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷等有机溶剂的高聚合化合物[9]。茶褐素是以茶叶中的多酚类物质为主要原料，在儿茶酚氧化酶、漆酶、过氧化物酶等酶类的作用下，经过氧化形成邻醌类物质，邻醌进一步氧化聚合形成茶黄素、茶红素，再进一步与其它物质偶联氧化聚合形成茶褐素[10-14]。

茶园通常在每年的十月到来年二月，剪去茶树顶端不整齐的枝叶，使蓬面平整形成水平或弧形，降低冬季茶树叶的营养消耗，有利于提高来年春茶的品质。冬季修剪茶叶是提高茶叶品质的重要手段，同时修剪下的茶树老叶中也含有大量的多糖、多酚等营养物质。

目前茶褐素的制备方法有从固态发酵的普洱熟茶或黑茶中提取，采用化学或酶促法合成茶褐素等[15]。从普洱熟茶或黑茶中提取存在诸如发酵周期较长，分离纯化比较困难，发酵过程难控制等问题[16-17]，而化学法[18-19]或酶促转化[20-21]等方法存在化学试剂易污染环境，酶促反应的酶制剂成本较高等问题。鉴于此，本文采用冬季茶园茶树修剪老叶的水提物为原料，以固态发酵中分离纯化的塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）CGMCC.10022 为发酵菌种，进行液态发酵制备茶褐素，以期实现对茶园冬季修剪茶树老叶的废物利用，降低茶褐素的生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常大叶晒青茶、粗老大叶晒青茶和冬季茶树修剪老叶均由普洱澜沧古茶股份有限公司提供，其中正常大叶晒青茶、粗老大叶晒青茶所用鲜叶分别为3 级（一芽二、三叶占50%以上，同等嫩度其它芽叶占50%以下）和4 级（一芽三、四叶占70%以上，同等嫩度其它芽叶占30%以下）[1]；所用化学试剂均为分析纯级。

塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）CGMCC.10022 从普洱茶固态发酵中分离纯化的优势菌种，保藏于中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与设备

BS210S 电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪，上海亚荣仪器厂；FD5-3真空冷冻干燥机，金西蒙；ELX808 酶标仪，美国博腾公司；HS153 卤素水分活性测定仪，瑞士BD Biosciences；CM-5 分光色差仪，日本Konica Minolta 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 理化性质测定 水分采用卤素水分仪测定；pH 值用pH 计测定；色差用分光色差仪测定；茶黄素、茶红素和茶褐素的含量用萃取比色法测定[22]；水溶性氨基酸用茚三酮比色法测定[23]；水溶性蛋白质用考马斯亮蓝法测定[24]；儿茶素的含量用香兰素比色法测定[25]；总多酚和总黄酮的含量用福林酚比色法测定[26-27]；水溶性总糖和多糖的含量用蒽酮比色法测定[22]。

1.3.2 发酵条件优化

1.3.2.1 茶树修剪老叶水提物制备 茶叶按照1∶15（g/mL）的质量浓度在沸水中浸提15 min，冷却后纱布过滤，再经滤纸过滤，滤渣复提1 次，合并2 次滤液，在65 ℃下减压浓缩，浓缩液经真空冷冻干燥后得到茶树修剪老叶水提物。

1.3.2.2 发酵条件单因素实验 以水提物质量浓度（5，10，20，40 g/L）、孢子接种 量（103，105，107CFU/mL）、摇床转速（0，100，200，300 r/min）和发酵温度（30，37，42，45 ℃）4 个因素进行单因素实验，所有发酵重复2 次。发酵过程每天取样4 mL，测定总多酚和茶褐素含量，所有测定重复3 次，以茶褐素的生成速率（QTB）和底物转化率（YTB/TP）为评价指标选出最佳条件。

1）修剪老叶水提物浓度 将1 mL，107CFU/mL 孢子悬浮液，分别接种至5，10，20，40 g/L 已巴士杀菌的水提物中，在37 ℃，200 r/min 下培养至茶褐素含量稳定。

2）孢子接种量 将制备好的孢子悬浮液稀释到合适的倍数，用血球计数板计数，分别将原孢子悬浮液稀释至103，105，107CFU/mL，分别吸取1 mL 孢子悬浮液，接种至10 g/L 已巴士杀菌的水提物中，在37 ℃，200 r/min 下培养至茶褐素含量稳定。

3）发酵温度 在10 g/L 已巴氏杀菌的水提物中接种1 mL，107CFU/mL 孢子悬浮液，分别在30，37，42，45 ℃发酵，转速为200 r/min 下培养至茶褐素含量稳定。

4）转速 在10 g/L 已巴氏杀菌的水提物中接种1 mL，107CFU/mL 孢子悬浮液，分别在0，100，200，300 r/min 发酵，发酵温度为37 ℃，直至茶褐素含量稳定。

1.3.2.3 发酵条件正交试验 根据单因素实验结果，选取水提物浓度（A）、培养温度（B）、摇床转速（C）三因素三水平即L9（33）进行正交试验，以茶褐素含量稳定为发酵终点，以底物转化率作为评价指标，筛选出最优发酵条件。

1.4 发酵参数计算及数据处理方法

发酵动力学参数根据Sirisansaneeyakul 等[28]的方法计算。数据以“”表示，所有数据先进行Grubbs 检验，以排除过失误差；经G 检验合格的数据，采用SPSS 19.0，用邓肯氏法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同嫩度茶叶理化性质比较

由表1 可知，不同嫩度茶叶的茶汤pH 均呈酸性，无显著性差异（P＞0.05）。茶树修剪老叶的L*和b*值显著高于嫩度更高的大叶晒青茶，而a*值则显著降低（P＜0.05），表明茶树修剪老叶的茶汤亮度高，偏黄绿色。

表1 不同嫩度茶叶理化性质比较Table 1 Physicochemical comparison of tea leaves varied with tenderness

正常和粗老茶叶之间成分差异小，除氨基酸、茶红素和水分外，其余成分均无显著性差异（P＞0.05）。茶树修剪老叶的3 种茶色素含量均显著小于正常和粗老茶叶（P＜0.05）。正常茶叶和粗老茶叶中茶色素含量最高的均为茶红素，而茶树修剪老叶则为茶褐素。茶树修剪老叶的多糖、氨基酸、蛋白质、总多酚、总黄酮、儿茶素、茶黄素、茶红素和茶褐素含量均显著低于正常茶叶和粗老茶叶（P＜0.05）；而修剪老叶的水溶性总糖显著高于正常茶叶和粗老茶叶（P＜0.05）。可能是由于冬季修剪老叶较其它茶叶生长时间更长，积累了更多的糖分，且主要为还原糖等糖类。总之，茶树修剪老叶含有丰富的水溶性物质，如碳水化合物、氨基酸、蛋白质等，可作为塔宾曲霉生长所需的碳源和氮源，同时含有一定量的总多酚（13.59%），可作为塔宾曲霉发酵合成茶褐素所需的底物。

2.2 塔宾曲霉发酵茶树修剪老叶水提物合成茶褐素的条件优化

不同单因素发酵条件下总多酚和茶褐素含量变化如图1 所示，发酵过程中多酚作为合成茶褐素的底物呈下降趋势，而产物茶褐素则呈上升趋势。在发酵的1～2 d，部分组别的总多酚含量有所提高（图a，c，e），这可能是与多酚的测定方法有关，本文采用的是福林酚法，该法以没食子酸作为校正标准定量茶多酚。而已有研究表明普洱茶固态发酵过程中，酯型儿茶素如EGCG 和ECG，会在微生物产生的酯酶等作用下水解产生没食子酸，因此发酵初期没食子酸呈上升趋势[29]，从而导致所测总多酚亦呈上升趋势。

图1 不同单因素发酵条件下茶多酚和茶褐素含量的变化Fig.1 Changes of tea polyphenols and theabrownin under different single factor fermentation conditions

2.2.1 不同浓度修剪老叶水提物对塔宾曲霉合成茶褐素的影响 从图1b 可知水提物质量浓度为5，10，20 g/L 时，茶褐素含量都在发酵第9 天时达到最大，分别为2.92，5.25，8.88 g/L，分别是发酵初始的3.07，2.88，2.62 倍，随后保持稳定。由表2 可知，茶树修剪老叶水提物质量浓度为10 g/L 和20 g/L 时，茶褐素生产速率（QTB）较高，且在10 g/L 水提物质量浓度时底物转化率最高，故选择10 g/L的水提物质量浓度作为发酵培养基。

表2 不同单因素发酵条件下塔宾曲霉合成茶褐素的发酵参数Table 2 Fermentation parameters of theabrownin production by Aspergillus tubingensis under different single factor fermentation conditions

2.2.2 不同孢子接种量对塔宾曲霉合成茶褐素的影响 由图1d 可看出孢子接种量为103，105，107CFU/mL，发酵14～15 d 后，茶褐素含量均达到最大值，分别为4.94，5.16，5.32 g/L。由表2 可知，接种量为105，107CFU/mL 时，茶褐素的生成速率和底物转化率均显著高于103CFU/mL（P＜0.05）。接种量为105，107CFU/mL 时，茶褐素的生成速率和底物转化率均无显著差异（P＞0.05），而接种量为107CFU/mL 时，底物转化率略高于105CFU/mL，故选用107CFU/mL 作为后续孢子接种量。

2.2.3 不同温度对塔宾曲霉合成茶褐素的影响如图1f 所示，发酵温度为37 ℃和42 ℃时，茶褐素的生成快于30 ℃和45 ℃，发酵6 d 时，30，37，42，45 ℃下，茶褐素的含量分别为4.30，4.95，4.91，4.24 g/L，表明温度过低或过高均不利于塔宾曲霉的生长及其胞外酶的分泌，以及胞外酶氧化多酚合成茶褐素的酶催化作用。发酵温度为37 ℃和42 ℃时，茶褐素的生成速率显著高于30 ℃和45℃（P＜0.05），而两者的底物转化率无显著差异（P＞0.05）（表2），从节能角度出发，后续试验选用37℃作为发酵温度。

2.2.4 不同转速对塔宾曲霉合成茶褐素的影响由图1h 可知，静置和100 r/min 下，氧气供应不足，茶褐素的生成较少，发酵2 d 时，茶褐素含量分别为2.18 g/L 和2.39 g/L，仅为发酵初始的1.65倍左右，随后保持稳定。而200 r/min 和300 r/min下，茶褐素含量最高可达5.00 g/L，约为发酵初始的3.75 倍。表明塔宾曲霉的生长及茶褐素的合成均需氧气参与。由表2 发酵参数可知，转速为200 r/min 和300 r/min 时，底物转化率显著高于静置和100 r/min（P＜0.05），且200 r/min 底物转化率最高，因此后续试验选用200 r/min。

根据上述单因素实验结果得到塔宾曲霉利用茶树修剪老叶合成茶褐素的较佳条件为茶树修剪老叶水提物质量浓度10 g/L，温度37 ℃，孢子接种量107CFU/mL，摇床转速200 r/min。正交试验选取老叶水提物质量浓度（A）、培养温度（B）、摇床转速（C）三因素三水平即L9（33），以茶褐素含量稳定为发酵终点，以底物转化率作为评价指标，结果如图2 和表3 所示。

图2 正交试验优化下总多酚和茶褐素的变化Fig.2 Changes of total polyphenols and theabrownin optimized by orthogonal design

表3 正交试验优化下塔宾曲霉合成茶褐素的发酵参数Table 3 Fermentation parameters for theabrownin production by Aspergillus tubingensis optimized by orthogonal test

如图2 所示，采用不同质量浓度水提物时，发酵过程中总多酚和茶褐素的含量变化趋势相同，总多酚均在0～3 d 时大量下降，随后逐渐稳定。水提物质量浓度为5 g/L 和15 g/L 时，茶褐素含量在第6 天时稳定，水提物质量浓度为10 g/L 时，茶褐素含量在第7 天稳定。在水提物质量浓度为10 g/L，发酵温度40 ℃，摇床转速150 r/min 时，茶褐素的含量变化介于水提物质量浓度为10 g/L，发酵温度37 ℃，摇床转速250 r/min 和水提物质量浓度为15 g/L，发酵温度34 ℃，摇床转速250 r/min 之间，茶褐素最终含量可达到5.78 g/L。

通过比较表3 中YTB/TP的极差r可知，各因素关系为B＞C＞A，即影响塔宾曲霉利用茶树修剪老叶水提物合成茶褐素的因素依次为发酵温度＞摇床转速＞水提物质量浓度；最佳因素水平组合为A2B3C1，即最佳的发酵条件为茶树修剪老叶水提物质量浓度为10 g/L，发酵温度为40 ℃，摇床转速为150 r/min。在最优条件下，茶褐素含量为5.78 g/L，茶褐素的生成速率为0.026 g/L·h，底物转化率为3.922 g/g。

3 结论

正常和粗老大叶晒青茶的成分差异较小，而冬季茶树修剪老叶除总糖高于正常和粗老大叶晒青茶外，其余均低于二者。冬季茶树修剪老叶含有丰富的水溶性物质，可作为塔宾曲霉生长所需的碳源和氮源。以冬季茶树修剪老叶水提物为培养基，接种塔宾曲霉进行发酵，合成茶褐素的最优条件为修剪老叶水提物质量浓度为10 g/L，发酵温度为40 ℃，摇床转速为150 r/min。在最优条件下，茶褐素含量为5.78 g/L，生成速率为0.026 g/L·h，底物转化率为3.922 g/g。