自然发酵腊肉中细菌的分离鉴定及其发酵特性

张秋会，孟高歌，王 晗，刘 昶，崔文明，王小鹏，祝超智，赵改名

（河南农业大学食品科学技术学院 郑州 450002）

发酵肉制品是指肉品在自然或人工控制的低温环境中，通过微生物发酵制成的一种营养丰富、风味独特且具有较长保质期的肉制品[1-2]。腊肉是以畜肉为主要原料，配以其它辅料，经过腌制、烘干、烟熏等工艺加工而成的肉制品，因其多在农历腊月制得而得名，是中国传统的腌腊肉制品[3]。腊肉凭借较长的保质时间，独特的风味及口感，深受广大消费者的喜爱。

目前，中国市场上的腌腊肉制品多以散户生产、手工作坊制作形式。由于受作坊技术限制以及生产条件的局限性，此类肉制品中的微生物在自然条件下培养、发酵，无法通过科学的方式对产品中微生物的生长情况进行有效调控，导致产品质量参差不齐，货架期不稳定，甚至使产品出现质量与安全问题[4-5]。鉴于此，需要结合我国传统发酵技术，同时借鉴西式发酵肉加工工艺，使国内发酵肉制品实现规模化、专业化生产，以保障产品质量[6]。由于我国传统发酵肉制品行业起步较晚，缺少适用于工业化生产的发酵剂，因此，需要筛选出活性强、发酵特性优良的优质菌种[7]。寻找能够满足人们对风味要求的微生物发酵剂，成为发酵肉制品的重要研究方向之一[8-9]。

腌腊肉制品中微生物菌群主要为葡萄球菌、乳酸菌等细菌和酵母菌、霉菌[10]。这些微生物的存在对于腌腊肉制品的风味、质地、口感以及贮藏时间等均会产生直接影响[11]。相关研究表明，不同种类的菌株具有不同的发酵性能，赋予制品不同的品质特性。例如，葡萄球菌属于微球菌属，在发酵肉制品的成熟过程中，具有加快发色，缩短成熟时间，降低成本以及控制病原菌和腐败菌的生长等作用[12]。将葡萄球菌作为肉制品发酵剂具有良好的还原硝酸盐的能力，可以降解亚硝酸盐生成氨，从而减少发酵肉制品中亚硝胺化合物的产生。同时对发酵肉制品特有风味的形成有重要作用。

本研究以市售农家自制信阳腊肉、四川绵阳腊肉、湖南腊肉以及云南腊肉为菌株分离来源，筛选其中优势菌株进行分离、纯化，并进行生物学鉴定。选择具有较高耐盐性、耐亚硝酸盐性、耐酸性的菌株进行发酵特性研究，寻找能够满足腊肉生产所需，同时具有良好发酵特性的菌株，为肉制品发酵剂的开发及发酵肉制品加工的优化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

信阳腊肉，河南信阳农家自制；四川腊肉，四川绵阳农家自制；湖南腊肉，湖南衡阳湘西腊肉农家自制；云南腊肉，云南普洱农家自制；孟加拉红琼脂，北京奥博兴生物技术有限责任公；YPD 液体培养基，青岛海博生物；细菌DNA 提取试剂盒，北京天根试剂；牛肉浸粉、蛋白胨、TTC、葡萄糖、碳酸钙、氯化钠、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺等均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

AIRTECH-SW-CJ-2FD 无菌工作台，美国Airtech 公司；TU-1901 紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；梯度PCR 仪，Tprofessional Thermovycler；DYY-12 电泳仪，北京市六一仪器厂；均质机，Easy MIX；VORTEX GENIUS3 涡旋震荡器，美国Scientific Industries 公司；低温培养箱，BINDER。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化 取农家腊肉样品25 g置于无菌均质袋中，并加入生理盐水225 mL，混合后使用均质机进行均质。将均质后的样品倒入无菌试管中，使用无菌生理盐水稀释（1∶10），取100 μL 的稀释液在孟加拉红琼脂平板上进行涂布，将平板置于37 ℃无菌培养箱中培养24～72 h，从中挑选出符合酵母菌形态的菌落，进行反复划线纯化[13-14]。试验全程遵循无菌操作。

1.3.2 16S rDNA 分子生物学鉴定 生物学鉴定参考赵改名等[15]的方法。挑取单菌落于PCR 管中，使用细菌DNA 提取试剂盒细菌提取的DNA 作为模板，使用16S rDNA 通用引物27F（5-A GAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1482R（5-GGT TACCTTGTTACGACTT-3）作为上、下游引物进行PCR 扩增。

PCR 反应体系（50 μL）：模板5 μL，Taq PCR Master Mix 25 μL，ITS1 5 μL，ITS4 5 μL，ddH2O 10 μL；PCR 反应条件：第1 阶段：95 ℃预变性5 min；第2 阶段：95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 个循环；第3 阶段：72 ℃延伸5 min：第4 阶段：4 ℃终止反应。

1.3.3 菌株特性的研究

1.3.3.1 生长曲线和产酸曲线的测定 生长曲线和产酸曲线的测定参考高绍金[16]的方法，并稍作修改。按体积分数为1%将活化3 次的菌液接种于YPD 液体培养基中，在37 ℃培养36 h，平均2 h取1 次样，测定其pH 值，并使用紫外分光光度计测量其在波长600 nm 下OD 值。

1.3.3.2 菌株耐盐特性 参考徐鑫等[17]的方法，将活化后的菌株按照体积分数1%接种于NaCl 含量为0%，2%，4%，6%的4 组YPD 液体培养基中，并将培养基置于37 ℃无菌培养箱中培养24 h，将所得产物用紫外分光度计在波长600 nm 下测定OD值。

1.3.3.3 菌株耐亚硝酸盐特性 菌种耐亚硝酸盐特性的测定方法：将活化后的菌株按照体积分数1%接种于NaNO2含量为0，50，100，150 mg/kg 的4 组YPD 液体培养基中，并将培养基置于37 ℃无菌培养箱中培养24 h，将所得产物用紫外分光度计在波长600 nm 下测定OD 值[18-19]。

1.3.3.4 菌株耐酸特性 将活化后的菌株按照体积分数1%接种于pH 为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0 的7 组YPD 液体培养基中，并将培养基置于37 ℃无菌培养箱中培养24 h，将所得产物用紫外分光光度计在波长600 nm 下测定OD 值[19]。

1.3.3.5 产醇试验 将活化3 次的菌液在孟加拉红固体培养基上划线，倒置于37 ℃无菌恒温培养箱中培养2 h。后将TTC 上层培养基倒入孟加拉红固体培养基中覆盖初始菌落，再次于37 ℃无菌恒温培养箱中培养4 h 后取出培养基，观察并记录菌落的呈色情况[19]。

1.3.3.6 葡萄糖产气试验 采用杜氏小管发酵法，将活化3 次的菌株按照体积分数1%接种到葡萄糖产气培养基中，在37 ℃无菌恒温培养箱中培养24 h 后，观察杜氏小管中有无气泡产生并记录[19]。

1.3.3.7 产黏液试验 吸取适量菌液接种于MRS固体平板培养基中，将其在30 ℃恒温条件下培养48 h，挑取菌落观察、记录[19]。

1.3.3.8 蛋白质降解活性试验 将培养好的菌液取0.1 mL 滴入添加15%脱脂乳的固体MRS 培养基中，涂布均匀，于37 ℃恒温条件下培养48 h。当牛乳中酪蛋白被分解后，观察菌落周围出现的透明环，根据现象判定菌种有无蛋白质降解活性[20]。

蛋白质降解培养基：在孟加拉红固体培养基中加入15%的脱脂牛奶，121 ℃灭菌15 min。

1.3.3.9 脂肪分解活性试验 将培养好的菌液取0.1 mL 滴入添加了15%猪油和中性红指示剂的固体MRS 和乳清培养基中，涂布均匀，于37 ℃恒温培养48 h。观察并记录结果。如培养基上出现红色斑点，表明菌株分解脂肪并产生脂肪酸，反之为不分解[20]。

1.4 数据统计处理与分析

所有试验均重复3 次，试验结果表示为“平均值±标准差”。所得数据均使用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析，使用Origin 作图。数据间的分析采用单因素方差分析（One-way ANOVA），显著性水平均设定为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 腊肉中微生物的分离与鉴定

利用菌株分离纯化方法，对市售4 种农家自制腊肉中的细菌进行分离纯化，获得16 株细菌，分别标记为X49、X51、X52、S48、S50、S51、Y50、Y51、Y54、H39、H40、H42、H43、X9、X10、X12。

将筛选出的16 株菌株的基因组进行PCR 扩增，并进行电泳检测，电泳结果见图1。由图1 可知样品的扩增产物约为1 500 bp，所有条带分子质量大小符合理论预期。

图1 PCR 凝胶成像Fig.1 PCR gel imaging

利用NCBI 数据库，对16 株菌株的DNA 序列进行比对，BLAST 分析，鉴定出腊肉中细菌的种类，鉴定结果见表1。由表1 可知，信阳腊肉中含有乳链球菌、肠膜明串珠菌，四川腊肉中含有腐生葡萄球菌，云南腊肉中含有木糖葡萄球菌，湖南腊肉中含有马葡萄球菌。从中选取X49、X10、S50、Y51、H42 作为代表进行后续试验。

表1 腊肉中16 株分离菌株的鉴定结果Table 1 Identification results of 16 strains isolated from bacon

2.2 腊肉中细菌的发酵特性研究

2.2.1 耐盐特性研究 传统腊肉通常依靠添加大量食盐以降低产品的水分活度，来达到抑制微生物生长的目的，导致传统腊肉的食盐含量普遍较高，因此耐盐性是选择腊肉发酵菌种的重要指标之一[21]。腊肉中食盐添加量一般为4%～6%，且随着发酵时间的延长，产品水分含量逐渐降低，盐浓度会相应升高，因此要求菌株对NaCl 有较高的耐受性，使其能够在发酵过程中保持一定的活性并发挥作用。

图2 是5 种细菌的耐盐特性研究结果。由图2 可知，乳链球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、马葡萄球菌对食盐有很强的耐受性。肠膜明串珠菌对NaCl 比较敏感。随着NaCl 浓度的增大，X10活性下降最为明显，盐的添加量增长至4%的过程中，X10 的活性几乎呈现直线型下降趋势，而在含量为4%～6%区间内，下降趋势稍缓，推测是菌株几乎完全失活所致；Y51 与S50 的活性总体呈下降趋势，当添加量达到6%时，菌株活性几乎丧失；而H42 与X49 在整个试验过程中表现十分稳定，对食盐有较强的耐受性，而在整个试验过程中，H42 活性始终强于X49 活性。

图2 5 种细菌的耐盐性Fig.2 Salt tolerance of 5 species of bacteria

就菌株耐盐性能而言，当盐的添加量到达6%时，X10 菌株的吸光度下降了85.2%，H42 菌株吸光度下降了25.14%，Y51 菌株吸光度下降了47.06%，S50 菌株的吸光度下降了51.85%，X49 菌株吸光度升高了19.49%。H42 表现稳定，耐受性较高，且活性较强，能够满足腌腊肉制品食盐浓度所需；其次X49 耐受性最高，而初始活性不足；Y51 和S50菌株耐盐性差异不明显；X10 菌株对食盐最为敏感，且初始活度最好。结果表明，在高盐浓度下，H42 较为合适；在盐含量为4%时，H42 与X10 较为适宜；在盐含量低至2%时，H42、X10 与Y51 菌株表现良好。因此筛选出5 株菌株，H42 与X10 适用作为发酵肉中的细菌发酵剂，而H42 对食盐表现最为优异。

2.2.2 耐亚硝酸盐特性研究 亚硝酸盐一直作为食品添加剂广泛应用于肉制品加工中，其主要目的是促进产品发色，改善产品风味，抑制有害菌的生长[22]。根据国标规定亚硝酸钠和亚硝酸钾最大使用量为0.15 g/kg，最大残留量不得超过50 mg/kg。本试验设置亚硝酸盐最高浓度梯度为最大使用量上限。

图3 是5 种细菌的耐亚硝盐特性研究结果。由图3 可知，乳链球菌、肠膜明串珠菌对亚硝盐有较强的耐受性。腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、马葡萄球菌对亚硝盐比较敏感。

图3 5 种细菌的耐亚硝盐性Fig.3 Nitrite tolerance of five kinds of bacteria

随着亚硝酸盐浓度增加，S50、Y51、H42 均呈明显下降趋势，说明这3 种菌株对亚硝酸盐较为敏感；X49 与X10 在试验进程中，吸光度并无明显的波动，证明这两种菌具有较强的耐亚硝盐性。当亚硝盐含量到达150 mg/kg 时，X10 菌株吸光度下降了4.66%，H42 菌株吸光度下降了95.36%，Y51菌株吸光度下降了94.40%，S50 菌株吸光度下降了91.96%，X49 菌株吸光度下降了21.24%。

因此就菌株耐亚硝酸盐性能而言，X10 菌株对亚硝酸盐的耐受性最强，同时活度较高[21]；X49菌株对亚硝酸盐耐受性次之，较为稳定，而菌株活度较低。结果证明：高亚硝酸盐浓度对5 株菌株均有明显的抑制现象，在100 mg/kg 时，H42、X10、X49 较为适宜，其中X10 和X49 对亚硝盐的表现更为稳定。

2.2.3 耐酸性的研究 在肉制品的发酵过程中，乳酸菌具有较强的产酸能力，会改变肉品的pH环境，因此要求所筛选得到的细菌发酵剂应该具有较高的耐酸能力[23]。

图4 是5 种细菌的耐酸特性研究结果。由图4 可知，5 株菌株对酸性都十分敏感。

图4 5 种细菌的耐酸性Fig.4 ACID resistance of 5 species of bacteria

根据调查，传统腌腊肉制品pH 值在5.5～6.0的范围中，此时菌株中X10 的活性最强，远高于其它4 株菌株的活度，其它4 株菌株的吸光度无明显差异且较低。当pH 值下降至5.5 时，X10 吸光度下降了3.58%，S50 吸光度下降了22.54%，H42吸光度下降了23.62%，X49 吸光度下降了15.12%，Y51 吸光度升高了13.27%，可知在较高pH 值时，X10 菌株与Y51 菌株具有较好的耐受性，适用于肉制品的发酵；当pH 值下降至4.5 时，X10 菌株吸光度下降了81.29%，S50 菌株吸光度下降了90.52%，H42 菌株吸光度下降了99.46%，X49 吸光度下降了99.40%，Y51 的吸光度下降了98.70%，可知当pH 值下降至一定程度时，菌株几乎完全失活，X10 菌株由于初始活度更高，依旧具有较高的吸光度。

就菌株耐酸性能而言，在正常发酵肉制品的pH 值条件下，5 株菌株均可以作为微生物发酵剂使用，然而X10 菌株的表现更加优异。然而当环境pH 值过低时，严重抑制菌株生长，因此可以在发酵过程中通过一些手段控制酸度，使发酵正常进行。

2.2.4 菌株的生长曲线和产酸曲线的研究 图5为5 株菌株的生长曲线。由图5 可知S50、X49、Y51、H42 菌株在0～8 h 时为迟缓区，此阶段菌株的生长速度较为缓慢。X10 菌株的迟缓区较短，很快就进入对数区，在12 h 之后进入稳定期。而X10菌种的活性最强，菌液浓度全程显著高于另外4株菌株。

图5 菌株的生长曲线Fig.5 Growth curve of the strain

图6 为5 株菌株的产酸曲线。由图6 可知H42 菌株的pH 值下降最快，初始pH 值为6.68，在6 h 时pH 值下降为6.04；其次为H42 菌株，初始pH 值为5.54，在6 h 时pH 值下降为4.95；而其余S50、X49、Y51 菌株的产酸能力差异不明显。

图6 菌株的产酸曲线Fig.6 Acid production curve of the strain

结合图5 与图6 曲线可知，5 株菌株的产酸曲线与生长曲线相对应，其中迟缓区、对数区和稳定期时间基本一致。其中X10 的产酸能力最强，且增长较快，具有较高的活度；H42 在前期具有较强的产酸能力以及生长能力；而其它3 株菌株并无明显差异，这与张晓琼等[20]的结果相差不大。

2.2.5 细菌的主要发酵特性 表2 是细菌的主要发酵特性结果。根据表2 可知，产气、产醇、产黏液、脂肪分解能力、蛋白质降解能力试验结果均为阴性。

表2 细菌的主要发酵特性Table 2 Main fermentation characteristics of bacteria

在肉制品生产过程中，微生物可以利用发酵基制中的糖分，并将其转化为醇类物质，从而赋予发酵肉制品独特的风味。由表2 可知，产醇试验中，根据最终菌落的呈色情况判断，5 株菌株均不产醇，可以认为肉制品的风味物质是由其它种类微生物发酵而来。

在肉制品的发酵过程中，微生物会产生气体，破坏肉制品的品质、风味以及产品外观，对产品质量造成严重的影响，甚至会产生安全问题。由表2可知，产气试验结果中，杜氏小管内均没有产生气泡，表明5 株菌株均不产气。

肉制品表面产生黏液，是在肉制品加工或者贮存过程中，由于微生物作用导致。黏液的存在会影响产品的质量、风味以及感官，甚至引发产品安全问题。因此进行产黏液试验是十分必要的。由表2 可知，产黏液试验中，挑取菌落观察可知，5 株菌株均不产黏液。表明在试验条件下，5 株菌株的安全性均符合作为发酵剂的要求。

在肉制品中，微生物具有过强的蛋白质降解能力以及脂肪分解能力，会消耗营养物质产生过多的芳香物质，从而导致产品不被消费者接受，销量降低[24]。由表2 可知，5 株菌株在试验的生长过程中均不消耗蛋白质与脂肪，可以认为5 株菌株的蛋白质与脂肪的分解能力较低，未被检出。

3 结论

本试验从4 个特色自制腊肉产品中筛选出16 株细菌，鉴定为乳链球菌、肠膜明串珠菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、马葡萄球菌。从中选择5 株细菌进行发酵特性研究，结果表明，肠膜明串珠菌的生长速率最快，可以作为肉制品发酵剂的潜在菌株；马葡萄球菌和肠膜明串珠菌可以在高盐环境下发酵；乳链球菌、肠膜明串珠菌可以在高亚硝酸盐的环境下发酵；在肉制品发酵的正常酸度下，5 株菌株均可正常发酵，肠膜明串珠菌可以在酸性较低的环境下发酵。同时，5 株菌株均不分解蛋白质和脂肪，不产生黏液、不产气、不产氨、不产H2S，因此，乳链球菌、马葡萄球菌、肠膜明串珠菌有望在腊肉的工业生产中作为细菌发酵剂进行使用。