基于网络药理学探索三七治疗脑卒中的作用机制

王惠洁，董艺薇，刘 健，梁亚杰，陈 莹，苑舒文，赵果毅

（山西中医药大学基础医学院，山西 晋中 030619）

三七[Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen]为五加科人参属植物，又名人参三七、参三七、文三七、田七等，主产于云南文山、马关、广南及江西田阳、田东等地，以干燥根和根茎入药。主根多呈现类圆锥形或圆柱形，表面颜色呈灰黄色或灰褐色，气微味淡，入口味苦而后回甜。《本草纲目拾遗》中记载“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参、三七为中药之最珍贵者”。

脑卒中（cerebral stroke）又称“中风”“脑血管意外”（cerebralvascular accident，CVA），是目前常见的神经内科疾病，病症涉及范围广，每年都在威胁着不少患者的性命，即使存活下来也有着极高的致残率[1]。脑卒中是中老年人较为常见的疾病，也是中国成年人残疾的首要原因，其病因复杂多样，患病率、死亡率和致残率高，为家庭乃至社会带来了较大的经济负担。

网络药理学作为一门新兴学科，其研究过程以网络分析为核心技术，通过寻找药物、疾病的基因和靶点，通过数据库建立联系，构建网络进行可视化分析，使疾病和药物的关系一目了然，重视疾病与药物之间的相互作用，对药物和疾病的研究更加深入与精准[2]。本研究以三七有效活性成分—靶点—疾病（卒中）的构架整理出关键节点等，形成对研究对象的整体描述，为阐明三七治疗脑卒中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 筛选三七的活性成分

通过TCMSP（中药系统药理学分析平台，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）查询三七所含有的化学成分。类别选中“herb name”，并输入关键字“三七”作为词干在搜索框中进行检索，在“latin name”一 栏 中 选 中“Panax Notoginseng（Burk.）F.H.Chen ex C.Chow”后得到三七化学成分的各类信息，如分子名、口服生物利用度（OB）、药物相似性（DL）、血脑屏障（BBB）、药物半衰期（HL）、分子量（MW）等，在药物所参与的ADME（吸收、分布、代谢、排泄）特性过程的基础上，筛选出“OB≥30%”且同时满足“DL≥0.18”的化学成分，作为此次研究中使用的三七的活性成分。

1.2 预测三七活性成分靶点及获得作用靶点

1.2.1 预测三七活性成分的潜在作用靶点

首先使用PubChem化学数据库平台（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 检 索 上 一 步 骤中获取的所有活性成分，并分别记录下他们的Smiles 编 号、InChiKey 数 值，再 利 用Swiss ADME 数 据 库（http：//www.swissadme.ch/）中 的SwissTargetPrediction功能，在select a species中选homo sapiens，将收集到的Smiles号粘贴到搜索框中，或使用PubChem保存化学式的2D图片将其导入，得到该活性成分的预测靶点。下载Excel表格文件，将probability为0的删除，得到全部活性成分的预测靶点，并将活性成分对应的靶点名称规范化。

1.2.2 获得三七治疗脑卒中的作用靶点

DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca/）是来自阿尔伯塔大学的生物信息学和化学信息学数据库，该数据库可将详细的药物数据与全面的药物靶标信息相结合。在搜索框中输入“cerebralvascular accident”并搜索，获得脑卒中相关靶点基因，并将其规范化，将结果与上一步三七活性成分的作用靶点取交集，获得三七主要活性成分对脑卒中作用的靶点。

1.3 建立PPI 网络

STRING 数 据 库（https：//string-db.org/）是 一款可在线搜索已知蛋白相互作用关系的数据库，点击STRING数据库的search功能，选中multiple proteins，将1.2.2中整理的三七治疗脑卒中的靶点基因名称分别输入list of names一栏，在organism中选中homo sapiens，将输出的蛋白相互作用关系网以Excel形式保存。

1.4 取蛋白相互作用网络（PPI）交集分析核心靶点

利用Cytoscape 3.6.1软件将三七与脑卒中的PPI网络进行可视化处理，并选用Merge功能进行拓扑分析，查出核心靶点及其关系。

1.5 基因本体富集分析（geneontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

DAVID数据库（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）是一个集成了生物学数据和分析工具的数据库，可为大规模的基因和蛋白质列表提供系统而全面的生物学功能注释信息。使用在线GO生物学过程分析和KEGG通路富集分析，保留P<0.05的结果。

2 结 果

2.1 三七的主要活性成分

三七共有119 个化学成分，筛选条件取口服生物利用度（OB）≥30%且药物相似性（DL）≥0.18，共筛选出8个活性成分，结果见表1。

表1 筛选后的三七活性成分

2.2 三七活性成分的潜在作用靶点

活性成分潜在作用靶点共456 个，结果见图1。

图1 三七活性成分靶点预测

2.3 三七治疗脑卒中作用靶点的获取

通过DrugBank数据库获得脑卒中相关靶点69个（图2），与三七潜在作用靶点取交集，共5个靶点基因，分别是凝血因子Ⅱ（F2）、淀粉样前体蛋白基因（APP）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、细胞色素P4502C19（CYP2C19）和N-甲基-D-天冬氨酸离子型谷氨酸受体2B（GRIN2B）（图3），构建活性成分-核心靶点-疾病网络图，共13个节点，26条边线，结果见图4。

图2 脑卒中相关靶点

图3 三七活性成分预测靶点与脑卒中相关靶点交集

图4 活性成分-核心靶点-疾病网络图

2.4 蛋白相互作用网络（PPI）的拓扑分析结果

三七活性物质与脑卒中的靶点蛋白相互作用网络（PPI）根据拓扑分析结果显示APP与F2、MMP9、GRIN2B相互作用，联系密切（图5）。

图5 三七治疗脑卒中PPI 拓扑分析图

2.5 核心靶点的GO 功能及KEGG 通路富集分析结果

运用DAVID数据库一次性进行GO功能与KEGG通路富集分析，以P<0.05 进行筛选，结果显示这5 个基因参与的GO生物过程（BP）有离子型谷氨酸受体信号途径（ionotropic glutamate receptor signaling pathway）、肾上腺素受体信号途径（ephrin receptor signaling pathway）、细胞蛋白质代谢过程（cellular protein metabolic process）、白细胞迁移（leukocyte migration）、蛋白质磷酸化的正调控（positive regulation of protein phosphorylation）；参与的分子功能（MF）有丝氨酸型内肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、酶结合（enzyme binding）、受体结合（receptor binding）；相关的细胞成分（CC）有细胞外空间（extracellular space）、胞外区（extracellular region）。

以P<0.05进行筛选，KEGG通路分析显示有3个核心靶点基因参与脑卒中疾病的相关通路，分别是APP、CYP2C19、GRIN2B，涉及到的通路为5-羟色胺能突触（serotonergic synapse）和阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease），结果见表2。

表2 KEGG 通路分析结果

3 讨 论

脑卒中属中医学“中风”范畴，包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中两种，是由于脑供血障碍或血管破裂而造成的急性脑血管疾病，在临床上致残率、病死率均较高。三七是一种名贵中药材，现代药理学研究表明，三七及其总皂苷提取物具有多种生物活性，包括保护心脑血管系统及神经系统、抗肿瘤、抗菌抗炎、干预兴奋毒性、抗氧化及其他药理作用[3]。

三七可通过多条信号转导通路保护神经细胞。本研究通过GO功能富集分析发现三七与脑卒中关联的信号通路涉及离子型谷氨酸受体信号途径。GRIN2B 为N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asparticacid，NMDA）受体，谷氨酸受体中的离子型受体NMDA可调节神经元的存活、树突与轴突的结构发育和突触可塑性，对生物发育过程极为重要。脑缺血后，谷氨酸过度释放，造成谷氨酸堆积，促进NMDA受体活化，引起Ca2+内流增加，导致脑部微环境异常，最终产生兴奋性神经毒性反应，引起神经元凋亡[4]。研究发现，三七皂苷R1 可选择性作用于NMDA受体的NR1/NR2B亚型，竞争性抑制谷氨酸所导致的神经元细胞内钙超载，从而实现对小鼠神经元细胞的保护作用[5]。Wang Shiyun等[6]采用谷氨酸和钙微灌注法及光栓法诱导脑缺血，制备大鼠海马微环境紊乱模型，三七皂苷能够促进两种模型大鼠谷氨酸受体转运体-1的表达，抑制NMDA受体表达和细胞色素C（Cyt-C）释放，减轻兴奋性神经毒性。

本研究发现三七与脑卒中关联的信号通路涉及肾上腺素受体信号途径，与以往的研究是一致的。肾上腺素受体（adrenergic receptor，AR）是G蛋白偶连受体家族的代表性受体，在调节心血管系统活动中发挥基础作用，肾上腺素受体介导的信号发生异常可促进心血管疾病的发生发展[7]。肾上腺素受体介导的信号通路如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidy-linositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激酶B（protein kinase B，PKB即Akt）细胞通路，有研究发现三七皂苷类成分可促进 PI3K 和 Akt 蛋白磷酸化，激活P13K/Akt信号通路[8]。三七总皂苷（PNS）结合针灸治疗急性缺血性脑卒中大鼠具有显著的血脑屏障保护作用，可有效改善大鼠神经行为学状况，其作用机制可能与促进PI3K/Akt信号通路的激活有关[9]；三七提取物能够作为一种外源性调节因子，激活依赖于P13K/Akt的核因子红细胞系相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related facror 2，NRF2）抗氧化防御系统，抑制核转录因子-κB（NF-κB）炎症信号，从而减轻炎症反应[10]。

KEGG富集分析结果涉及APP基因，APP基因变异，在错误的位置被酶切会形成淀粉样蛋白沉淀。研究表明，三七总皂苷能在转录水平下调脑内APP基因的表达[11]，从而降低β-淀粉样蛋白（Aβ）的生成，改善快速老化模型小鼠的学习记忆能力。人参皂苷可促进APP以α-分泌酶方式进行剪切，抑制APP以β-分泌酶方式进行剪切，抑制γ-分泌酶活性，从而降低Aβ的生成[11]。研究表明，阿尔茨海默病（AD）和脑缺血常常并存，互相促进。脑卒中或脑血管病变加重AD患者的认知损伤并加速其衰老，同时患有AD和血管疾病的患者痴呆要严重得多。炎症是二者的共同特征之一，炎症既促进AD发展，又加重脑缺血损伤[12]。李爱东等[13]研究发现三七总皂苷可降低阿尔茨海默病患者炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-6（IL-6）水平，有效改善阿尔茨海默病患者临床症状和脑部灌注血流量，从而改善认知功能。

研究人员利用小鼠脑缺血模型研究发现，在海马体部分人参皂苷Rg1 和Rb1 能应对脑缺血再灌注引起的氧化应激，在皮层部分其主要是通过恢复细胞外信号调节激酶（extracellularregulated kinase，ERK）的磷酸化水平以诱导硫氧还蛋白1（thioredoxin，Trx-1）和细胞周期依赖蛋 白 激 酶5（cyclin dependent kinase，CDK5）的表达，从而达到保护脑组织的目的[14]。人参皂苷Rg1 和Rb1 都可抑制东莨菪碱诱导的5-羟色胺（5-hydroxytrptamine，5-HT）减少，发挥益智作用[15]。三七中的黄酮类成分槲皮素还具有降血压、降血脂、祛痰、强心等作用[16]。

综上所述，本研究初步预测了三七主要活性成分通过作用于疾病靶点APP、CYP2C19、GRIN2B治疗脑卒中，涉及抗炎、神经递质和受体的调节等多条信号转导通路，形成非常复杂的药理作用来保护脑神经细胞，这些发现为后续应用中医药研究和治疗脑卒中提供了理论基础。