基于网络药理学及“上病下取”理论探讨“苦杏仁-莱菔子”治疗儿童慢性咳嗽的作用机制

杨柳岸，白晓红，修 禅，吕启慧

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

儿童慢性咳嗽是指儿童以咳嗽为主要症状或唯一症状，咳嗽时间>4周且胸部X片正常的慢性咳嗽[1]。中医学根据其在临床上的表现，将其归属“久咳”“久嗽”等范畴。慢性咳嗽在儿童中多发，病程迁延不愈，具有易反复、治疗时间长、难以根治等明显区别于其他儿童呼吸道疾病的特点。目前通过中医疗法治疗儿童慢性咳嗽已经得到了广泛应用，并取得一定的成果，但大多数中医仅局限于采用清肺、润肺等治疗上焦的方法[2]，而忽视了“上病下取”的理念。本研究分析“苦杏仁-莱菔子”药对治疗儿童慢性咳嗽的理念及方法，同时通过网络药理学探讨治疗在儿童慢性咳嗽中可能的作用机制。

1 “上病下取”理论与儿童慢性咳嗽的关系

“上病下取”出自《素问·五常政大论》“病在上，取之下”，该治法是一种中医临床治疗手段，是中医整体观念的高度体现，旨在以治下而愈上。中医理念中，人体为一个有机且统一的整体，脏腑之间上下、左右均有关联，牵一发而动全身，中医治疗不应局限在疾病的局部临床表现，更应该判断疾病的本质[3]。儿童慢性咳嗽在中医学属肺系疾病，部分患儿伴有不同程度的便秘[4]，多表现为大便干燥粗长。肺与大肠相表里，对于肺系疾病的治疗，可从胃肠出发。《灵枢·本输》曰“肺合大肠，大肠者，传导之府”。肺气如果可以正常地进行肃降则大肠的传导功能便会正常，而大肠传导糟粕的功能如若失调，肺气便会在肃降方面失调，发生慢性咳嗽[5]。唐宗海曰：“大肠之所以传导者，以其为肺之腑。肺气下达，故能传导。”胃气如若上逆犯肺，则会发生咳嗽。如若通畅下焦气机，令肺气能够正常肃降，咳嗽症状便会缓解甚至消失[6]。该理念是中医整体观依据气机升降治则的精炼，与儿童慢性咳嗽联系颇深，对其治疗也有独到之处。

2 “苦杏仁-莱菔子”药对对儿童慢性咳嗽的治疗

苦杏仁，性味甘、苦，在人体气机运动中可升可降，乃阴中阳也，入肺、大肠经。苦杏仁具有利下、除肠中燥满之功，可除肠中郁结滞气，通畅胸中之满，对胸中气逆喘促亦有很好的功效，且油脂丰富，具有润肠功能，在临床表现为止咳、坠痰、通便。莱菔子，味辛、甘，入肺、胃经，既可以下气定喘，通达上焦气机，治疗肺系疾病，亦可以调理下焦气机，治疗食积气滞、脘腹胀满。《医学衷中参西录》中阐述莱菔子可以顺气开郁、消胀除满，乃化气之品，非破气之品，表明莱菔子作用于慢性咳嗽并不是直接止肺中之咳，而是化下气以通上气。同时莱菔子中最主要的成分萝卜苷具有消食化积功能，在促进肠运动中发挥了作用[7]。二者具有上下焦共治的联合作用，可疏通下焦气机而调节上焦气机，体现了“上病下取”的中医临床理念；二者都具有针对下焦病症的有效成分，在临床以及相关实验中已经证实对儿童慢性咳嗽有很好的疗效[8-10]。

3 网络药理学研究

3.1 材料与方法

3.1.1 “苦杏仁-莱菔子”药对中有效成分及活性物质的筛选

基于TCMSP数据库，以“苦杏仁”“莱菔子”为关键词进行搜索，以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18为标准，对苦杏仁、莱菔子的有效成分及其作用靶点进行筛选，再通过Unipro软件将筛选出来的靶点转化为简称。

通过使用GeneCard数据库（https：//www.genec ards.org/）、OMIM 数 据 库（https：//www.omim.org/）、PharmGKB 数 据 库（https：//www.pharmgkb.org/）、DrugBank 数 据 库（https：//go.drugbank.com/），以“chronic cough in children”为关键词查找与儿童慢性咳嗽有关的疾病基因，其中GeneCard数据库（https：//www.genecards.org/）以评分>1作为筛选条件，将4个基因数据库筛选出的疾病基因取交集并绘制Venn图。

3.1.3 药物作用靶点基因与疾病相关基因交集

将从两味中药筛选出的靶点基因合并，去除重复靶点基因；将从儿童慢性咳嗽疾病基因库中筛选出的疾病相关基因进行合并，去除重复基因。取二者交集，得到交集基因并绘制Venn图。

3.1.4 “苦杏仁-莱菔子”药对复方调控网络的构建

获取“苦杏仁-莱菔子”药对活性成分与儿童慢性咳嗽疾病基因的交集靶点基因。利用Cytoscape软件构建“活性成分-交集靶点”复方调控网络。计算各个节点的连接度，评估网络中各个节点的相互联系程度。

厂房建设以发展联合建筑为主，内部空间进行合理、明确的功能分区，将功能相近又互不影响的空间布置在一起，工作区域与非工作区域分开，工作线路与参观线路用不同道路线表示，生产车间与其辅助用房的安全出口分开设计。做到厂房内部动静分明，工艺流程一目了然，人员疏散线路安全流畅。

3.1.5 蛋白互作网络及网络核心的构建

利用STRING平台构建蛋白互作网络，将药物分子靶点与儿童慢性咳嗽相关靶点进行映射，以置信度≥0.4为标准筛选并隐藏孤立靶点，得到蛋白质-蛋白质相互作用信息，将蛋白互作网络的结果导入Cytoscape软件，通过CytoNCA插件对交集靶点进行拓扑分析，根据度中心性（DC）、接近中心性（CC）、介数中心性（BC）、局部平均中心性（LAC）、特征向量中心性（EC）以及网络中心性（NC）6项拓扑参数，以中位数为筛选条件进行筛选，构建PPI网络核心。

3.1.6 GO 基因功能和KEGG 通路富集分析

运用R语言将PPI网络核心靶标进行基因本体功能富集分析（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）通路富集分析，并绘制GO功能分析、KEGG通路富集分析的柱状图及圈图，用以分析中药有效活性成分、药物作用核心靶标及关键通路三者之间的关系。

3.2 结 果

3.2.1 “苦杏仁-莱菔子”主要活性成分及作用靶点

通过TCMSP数据库筛选收集得到苦杏仁有效成分16个，对应靶点207个；莱菔子有效成分2个，对应靶点3个。去除重复，得到70个靶点。结果见表1。

表1 “苦杏仁-莱菔子”有效成分及对应靶点基因信息

3.2.2 儿童慢性咳嗽疾病基因筛选

通过GeneCard数据库、OMIM数据库、Pharm-GKB数据库以及DrugBank数据库筛选出与儿童慢性咳嗽相关疾病基因共3941个，4个数据库交集基因共94个，绘制Venn图，结果见图1。

图1 4 个基因数据库儿童慢性咳嗽疾病基因Venn 图

3.2.3 将药物作用靶点基因与疾病相关基因取交集

将两味中药筛选出的靶点基因合并，去除重复，获得70个基因；将从4个基因数据库中筛选出的疾病相关基因合并，去除重复，获得3941个基因；取二者交集，得到47个基因，绘制Venn图，结果见图2。

图2 “苦杏仁-莱菔子”中有效成分靶点基因与儿童慢性咳嗽疾病基因的Venn 图

3.2.4 “苦杏仁-莱菔子”药对的复方调控网络

“苦杏仁-莱菔子”药对与儿童慢性咳嗽相关的有效成分共16 个，靶点基因共47 个，依托Cytoscape软件绘制“苦杏仁-莱菔子”药对的复方调控网络，共获得63个节点以及128条边，计算图中每个节点的连接度（degree），观察活性成分和靶点基因在网络中发挥的作用。结果见图3。

图3 “苦杏仁-莱菔子”药对的复方调控网络

3.2.5 构建蛋白互作网络

依 托STRING（https：//cn.string-db.org/）网 站构建交集基因的蛋白互作网络，分析“苦杏仁-莱菔子”和儿童慢性咳嗽的47个共有靶点，以置信度≥0.4为标准筛选并隐藏孤立靶点，得到蛋白互作网络，共含47个节点及306条连线。结果见图4。

图4 “苦杏仁-莱菔子”药对靶点与儿童慢性咳嗽靶点的蛋白互作网络

3.2.6 PPI 网络核心的构建

将蛋白互作网络中的基因依据BC、CC、DC、EC、LAC、NC的中位值BC=15.120 238 095 238、CC=0.411 214 953 271 028、DC=12、EC=0.129 108 443 856 239、LAC=5.333 333 333 333 33、NC=6.857 142 857 142 85 对靶点作进一步筛选，最终获得由12个核心靶点、145条边构建的PPI核心网络，核心蛋白分别为溶质载体系列6成员4（solute carrier family 6 member 4，SLC6A4）、热休克蛋白90阿尔法家族A类成员1（heat shock protein 90 alpha family class a member 1，HSP90AA1）、雌激 素 受 体1（estrogen receptor 1，ESR1）、前 列 腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、溶质载体系列 6成员3（solute carrier family 6 member 3，SLC6A3）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、单胺氧化酶B（monoamine oxidase B，MAOB）、乙 酰胆 碱 酯 酶（acetylcholinesterase，ACHE）、丝 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶14（mitogenactivated protein kinase 14，MAPK14）、孕 激 素 受体（progesterone receptor，PGR）、多 巴 胺 受 体D2（dopamine receptor D2，DRD2）、多 巴 胺 受 体D1（dopamine receptor D2，DRD1）。结果见图5。

图5 PPI 网络核心的构建

3.2.7 GO 与KEGG 富集结果

通过使用R软件包org.Hs.eg.db中基因的GO注释，将基因映射到背景集合中，使用R软件包clusterProfiler进行富集分析，获得基因集富集的结果。设定最小基因集为5，最大基因集为5000，以P<0.05 和错误发生率（FDR）>0.25 作为条件进行筛选，包括细胞组件（BP）、生物学过程（CC）、分子功能（MF）3 个组成部分，分别获得1000、293、364 条通路，核心靶点的BP依次与化学成分的反应（response to chemical）、生物质量的调节（regulation to biological quality）、细胞对化学刺激的反应（cellular response to chemical stimulus）等过程相关；CC与内膜系统（endomembrane member）、膜的固有成分（intrinsic component of membrane）、质膜部分（plasma membrane part）等相关；MF与阳离子结合（cation binding）、分子换能器活性（molecular transducer activity）、催化活性（catalytic activity）等相关，并分别筛选出前20条、前21条、前18条通路绘制柱状图，结果见图6A。

图6A 核心靶点GO 富集分析

图6B 核心靶点KEGG 富集分析

通过使用KEGG rest API（https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）获取最新的KEGG Pathway基因注释，将基因映射到背景集合中，使用R软件包clusterProfiler（version 3.14.3）进行富集分析，获得基因集富集的结果。设定最小基因集为5，最大基因集为5000，以P<0.05 和FDR>0.25 作为条件进行筛选，共得出167条通路，主要涉及神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligandreceptor interaction），癌 症 相 关 通 路（pathways in cancer）、代 谢 通 路（metabolic pathways）、多 巴胺 能 突 触（dopaminergic synapse）、钙 信 号 通 路（calcium signaling pathway），根据富集程度筛选出前24条通路绘制圈图，结果见图6B。

4 临床医案

李某，男，5岁，2021年10月17日初诊，主诉：反复咳嗽1年余。患儿1年来反复咳嗽，每月发作一次，现症见：流涕，咳嗽，有痰，痰质黏色黄，汗多，脾气可，纳差，夜眠不实，大便2 日一行，偏干。体格检查：神清状可，呼吸平稳，舌红，苔薄白。中医诊断：小儿咳嗽。证型：肺胃蕴热证。处方：玄参10 g，黄芩10 g，甘草3 g，柴胡6 g，桔梗6 g，防风6 g，炒莱菔子10 g，苦杏仁10 g，佛手6 g，连翘10 g，陈皮6 g，荆芥10 g，茯苓10 g，法半夏6 g。中药颗粒，12剂，口服。随诊。

二诊：2021年10月26日，患者自述咳嗽、饮食、便秘好转，夜眠不实改善，加白芷6 g，丝瓜络10 g，炒薏苡仁10 g，继服12剂。

三诊：2021年11月10日，患者症状好转，然近两天感冒，流清涕，喉咙不适，饮食可，便秘，大便干，2 日1 次。证型：风痰证。处方：太子参10 g，黄芩10 g，麸炒苍术10 g，甘草3 g，清半夏6 g，柴胡6 g，桔梗6 g，防风6 g，炒莱菔子10 g，苦杏仁10 g，陈皮6 g，荆芥10 g，辛夷6 g，炒鸡内金6 g。10剂，口服。

四诊：2021年11月25日，患者感冒好转，偶清嗓。处方：茯苓10 g，苦杏仁10 g，甘草3 g，桔梗6 g，炒莱菔子10 g，法半夏6 g，黄芩10 g，焦山楂10 g，木蝴蝶6 g，玄参10 g，连翘10 g，陈皮6 g，芡实10 g，石膏30 g。10剂，口服。

1年后电话随访，患者自述咳嗽明显减轻，1年内无明显反复咳嗽。

按语：该患者就诊时自述反复咳嗽超过1年，且发病频繁，每月发作一次，符合儿童慢性咳嗽的临床表现，同时初诊时除咳嗽外，伴有咳黄痰、纳差、大便干燥等明显肺胃蕴热表现，因此治疗时需兼具上下焦。4次治疗均根据症状改变进行不同程度的药物加减，根据初诊患儿的肠胃表现4次治疗均选择使用“杏仁-莱菔子”，前2次治疗中发挥了润肠通便、理下焦气机，继而清肺热、止咳的功效；后2次治疗风痰证感冒，亦发挥除肠燥、除肺燥、化痰的功效。杏仁如《医学启源》中所言“除肺中燥，治风燥在于胸膈”。《主治秘诀》亦云杏仁“润肺气，消食，升滞气”。《本草纲目》言“莱菔子之功，长于利气。生能升，熟能降，升则吐风痰，散风寒，发疮疹；降则定痰喘咳嗽，调下痢后重，止内痛，皆是利气之效”。二者通过共同调理上下气机，以下治上，在儿童慢性咳嗽的治疗中发挥巨大作用。

5 讨 论

小儿慢性咳嗽目前病因不明确且发病机制复杂，与成人咳嗽有明显差异。儿童慢性咳嗽可能源于感染后咳嗽、支气管扩张、气管软化和哮喘等，一旦过了青春期，咳嗽的病因可能趋向于成人常见的原因，即胃食管反流、上气道综合征等[11]。从中医学角度看，儿童慢性咳嗽的病因来源于各个脏腑，《内经》曰“五脏六腑皆令人咳，非独肺也”。鉴于中药成分的复杂性，本研究以“上病下取”理论作为出发点，从肠治肺，通过使用网络药理学的方法，从多维度出发，解读“杏仁-莱菔子”对于儿童慢性咳嗽治疗的作用机制。

通过网络药理学分析“杏仁-莱菔子”治疗儿童慢性咳嗽的各个成分可知，在“杏仁-莱 菔 子”中 左 旋 千 金 藤 啶 碱（l-SPD）、豆 甾醇（stigmasterol）、雌 酮（estrone）、甘 草 查 尔 酮B（licochalcone B）、乌药碱（machiline）与疾病基因的相关值较高，提示其为治疗作用的核心成分。目前的各项研究表明，l-SPD可通过突触前D1 受体引起其对PL锥体细胞自发兴奋性突触后电流（sEPSC）频率的影响，并且依赖于蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）信号通路，具有D1受体激动剂和D2 受体拮抗剂双重作用。同时l-SPD针对外源性添加的肾上腺素和神经释放去甲肾上腺素所诱导的α1肾上腺素，对其介导的收缩抑制作用可能有助于药物降压，用于松弛肠系膜小动脉血管[12-14]。豆甾醇具有抗炎作用，可能由糖皮质激素受体介导，在肠道和相关免疫细胞的分化和功能、对环境刺激的反应和吸收过程损伤方面的调节具有潜力[15-16]。雌酮是雌激素的一种，不仅可以促进女性生殖器官的发育以及维持第二性征，同时对心血管系统、内分泌系统、代谢系统等均有明显的影响[17]。甘草查尔酮B可以抑制巨噬细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体的活化，但对黑色素瘤抑制因子2（AIM2）或含NLR家族CARD域蛋白4（NLRC4）炎性小体的活化没有影响，是一种特异性NLRP3抑制剂[18]。乌药碱具有强心、抗肿瘤、缓解支气管哮喘、抗炎作用[19]。其中l-SPD、豆甾醇、甘草查尔酮B均具有抗炎、润肠、缓肠的作用，与本研究上病下取治疗咳嗽的理念趋同，更加表明了“上病下取”理念的正确性及科学性，为临床治疗儿童慢性咳嗽提供可行道路。

通过分析PPI网络可得到核心靶点主要包括SLC6A4、HSP90AA1、PTGS2、SLC6A3 等。SLC-6A4 多态性的频率和更高水平的5-羟色胺（5-HT）与肠易激综合征（IBS）显著相关，特别是在腹泻和腹痛患者中，提示SLC6A4是参与IBS发病机制的潜在候选基因，同时SLC6A4也是功能性消化不良以及肠易激综合征的病理因素之一[20-22]，从侧面印证了治疗消化系统可改善呼吸系统的理念。HSP90AA1通过调节自噬促进牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）诱导的肝细胞生长因子（HGFs）的炎症反应。3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）的加入进一步证实了自噬可能介导热休克蛋白90α家族A类成员1（siHSP90AA1）以增强炎症反应[23]。通过产生前列腺素，PTGS2在调节炎症反应中起关键作用[24]，在研究及查阅文献过程中发现SLC6A4、HSP90AA1、SLC6A3均在治疗精神类疾病例如抑郁症、自闭症等，也就是中医所述的情志病方面，具有直接或间接的作用[25-27]。可能对于儿童慢性咳嗽，情志方面的治疗与管理在一定程度上具有积极效果，从而打开了一条崭新的治疗儿童慢性咳嗽的思路，具体还需进一步证明。

通过对“杏仁-莱菔子”的关键靶标基因进行GO基因功能富集分析以及KEGG通路富集分析，可得出7条通路与儿童慢性咳嗽进展过程高度相关，可能是药对发挥治疗作用的主要途径。神经活性配体-受体相互作用信号通路是所有处于质膜上和细胞内外信号通路有关系的受体以及配体的集合，与炎症反应显著相关[28]。钙信号通路可以参与控制代谢、分泌、受精、增殖和平滑肌收缩等过程，在控制炎症反应中起到了一定作用[29]。cAMP信号通路可以改善气道炎症，通过激活PKA，继而促进环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）转录，将膜上的Gq蛋白活化，进一步激活蛋白激酶C，进而激活肌球蛋白轻链激酶，最后达到促进气道平滑肌松弛的结果[30]。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路可以通过影响人气道上皮细胞、支气管上皮细胞（16HBE）自噬的发生，改善人体气道炎症反应，也可以改善结肠的炎症反应，发挥对结肠的保护作用[31-32]。

综上，本研究通过对“上病下取”理论的深入探究以及通过网络药理学方法深层次、多维度研究“杏仁-莱菔子”药对对于儿童慢性咳嗽在上焦和下焦的多种作用机制，探查该药对核心靶点的生物效应，开创地提出了情志对于儿童慢性咳嗽可能存在的影响。本研究挖掘结果均通过查阅文献后得到了相应的证实，为未来相关研究提供了一定的参考及支持，但本研究结果仍需要在实验研究方面进行验证。