基于网络药理学探究肾炎消白颗粒治疗糖尿病肾病作用机制

蔡英杰，李浩经，蔡萧君，吴圆圆，林鹏展

（1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036；2.温州市中医院，浙江 温州 325000；3.温州市中西医结合医院，浙江 温州 325000）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是由糖尿病导致的慢性肾脏病，是糖尿病微血管并发症之一，临床特征为持续性白蛋白尿排泄率增高，肾小球滤过率进行性下降，是导致慢性肾脏病与肾衰竭的重要原因之一，同时也取代慢性肾小球肾炎成为我国慢性肾脏病的首要病因[1]。临床单纯以西医治疗DKD缺乏确切疗效，常中西结合治疗。

肾炎消白颗粒（Shenyan Xiaobai granules，SYXB）系黑龙江省中医医院院内制剂，依据名老中医张琪教授临床治疗蛋白尿经验方“肾炎消白方”研制而成，全方健脾益肾、清热解毒利湿，主治慢性肾病蛋白尿脾肾两虚、湿热内蕴证，临床治疗以蛋白尿为主要症状的慢性肾病效果良好。临床研究发现SYXB对慢性肾小球肾炎存在治疗效果[1]，但对DKD临床疗效的报道，仅存在动物实验的研究[2-4]。本研究基于网络药理学方法分析SYXB药物有效成分、活性靶点与疾病之间的相关性，为SYXB临床治疗DKD提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源网址及数据分析软件

1.1.1 数据来源网址

（1）中医药系统药理学平台（TCMSP）[5]（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；（2）PubChem 数 据 库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；（3）SwissTargetPrediction（数据库http：//www.swisstargetprediction.ch/）；（4）UniProt蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org/）；（5）GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org/）；（6）TTD 数 据 库（http：//db.idrblab.net/ttd/）；（7）OMIM 数 据 库（http：//www.omim.org）；（8）DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）；（9）Draw Venn Diagram平台（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；（10）STRING 11.0数据库（https：//string-db.org）。

1.1.2 数据分析软件

（1）Metascape平台（https：//metascape.org/）；（2）生物信息在线作图网站微生信（http：//www.bioinform atics.com.cn/）；（3）Cytoscape 3.8.2软件。

1.2 SYXB 药物成分靶点的筛选

SYXB主要成分为白茅根、党参、枸杞、黄芪、女贞子、芡实、山药、熟地黄、土茯苓、菟丝子、益母草、薏苡仁。通过挖掘TCMSP数据库，以上述药物为关键词进行搜索，依据口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，初步筛选出药物活性化合物及其作用的蛋白质靶点，根据已经发表的文献报道补充TCMSP未预测到的化合物靶点，于PubChem数据库寻找其化学结构式，于SwissTargetPrediction平台进行分子预测[6-9]。将筛选出的活性化合物靶点通过UniProt蛋白质数据库进行基因名称规范化。

1.3 糖尿病肾病靶点筛选

以糖尿病肾病（diabetic kidney disease）为关键词，挖掘GeneCards、TTD、OMIM、DisGeNET数据库获取其疾病潜在靶点，合并靶点并删除重复值后获得DKD疾病靶点。

1.4 构建SYXB“药物-成分-作用靶点”网络

通过Cytoscape 3.8.2 软件构建SYXB“药物-成分-作用靶点”网络，将筛选出的药物有效成分与作用靶点导入软件，运用network analyzer分析工具进行网络特征分析。

1.5 构建SYXB-DKD 靶点PPI 网络

构建SYXB-DKD靶点PPI网络，分析SYXB与DKD靶点间的联系，通过Draw Venn Diagram平台绘制出韦恩图，在STRING 11.0 平台中构建蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI），将物种限定为人，于Cytoscape 3.8.2软件中进行优化，并进行拓扑分析，预测关键靶点。

1.6 SYXB—DKD 关键靶点GO-BP、KEGG 分析

将关键靶点提交至Metascape平台进行基因本体-生物过程分析（Gene Ontology-biological process，GO-BP）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，运用Cytoscape 3.8.2 软件构建“SYXB—DKD关键靶点-通路”网络图，并利用微生信平台绘制GO-BP通路与KEGG通路的条形图。

1.7 构建“SYXB 活性成分-重合靶点-DKD-通路”网络图

通 过Cytoscape 3.8.2 构 建 出“SYXB 活 性 成分-重合靶点-DKD-通路”网络图，利用network analyzer分析工具进行网络特征分析，节点程度以连接度值调节，连接度值越大表明其生物活性越高，功能越齐全，重要性越高。

2 结 果

2.1 SYXB 药物成分靶点的信息

通过挖掘TCMSP数据库可获得白茅根有效成分4 种，作用靶点54 个；党参有效成分17 种，作用靶点102个；枸杞有效成分36种，作用靶点184个；黄芪有效成分17种，作用靶点190个；女贞子有效成分9种，作用靶点181个；芡实有效成分2种，作用靶点18个；山药有效成分12种，作用靶点70个；熟地黄有效成分2种，作用靶点29个；土茯苓有效成分15种，作用靶点188个；菟丝子有效成分10种，作用靶点193个；益母草有效成分8种，作用靶点183个；薏苡仁有效成分6种，作用靶点29个。合并删除重复值后获得药物有效成分共103种，作用靶点共271个。SYXB活性成分及网络标记见表1，主要有效成分信息见表2。

表1 肾炎消白颗粒活性成分及网络标记

表2 肾炎消白颗粒主要有效成分信息表

2.2 DKD 疾病靶点

通过挖掘GeneCards数据库可获得3512 个DKD疾病靶点，其relevance score中位数为4.88，将relevance score≥中位数的靶点设定为目标靶点，可获得846个靶点。继续挖掘OMIM数据库、DisGeNET数据库与TTD数据库补充相关靶点，共获得DKD疾病靶点952个。

2.3 SYXB“药物-成分-靶点”网络

将SYXB中103 种有效成分及271 个作用靶点数据导入Cytoscape 3.8.2 软件进行分析，并构建SYXB“药物-成分-靶点”网络图。结果见图1。图中节点表示靶点信息，边表示节点间的作用联系，网络图中共有387 个节点，936 条边，其网络度中心性均值为6.54，介度中心性均值为5.74×10-3，紧密中心度均值为0.32。

图1 肾炎消白颗粒“药物-成分-靶点”网络图

2.4 SYXB-DKD 靶点PPI 网络

将筛选出的SYXB靶点及DKD疾病靶点于Venn Diagram平台绘制韦恩图（见图2），可见其存在114 个共同靶点。通过STRING 11.0 平台构建SYXB-DKD靶点PPI网络（见图3），其中线段粗细代表数据支持强度（置信度），本研究置信度设为0.900，隐藏断开连接节，该网络图中节点数为114，预期边数102，边数415，PPI富集P<1.0×10-16，平均节点数7.28，平均局部聚类系数0.44，于Cytoscape 3.8.2 进行优化（见图4）。颜色越深，面积越大，代表度中心性越大。经拓扑分析示该网络中度中心性均值为8.30，介度中心性均值为1.72×10-2。选取度中心性与介度中心性大于均值的靶点，可筛选出23个关键靶点（见表3），占总节点的21.30%。

图2 SYXB-DKD 韦恩图

图3 SYXB-DKD 靶点PPI 网络

图4 SYXB-DKD 靶点PPI 网络优化图

表3 SYXB-DKD 关键靶点拓扑属性参数

2.5 GO-BP 与KEGG 通路富集分析

将关键靶点置于Metascape 数据库进行GO-BP富集分析以及KEGG通路富集分析，以P<0.01 为标准，结果显示23 个关键靶点可参与749条生物过程及220条KEGG通路。依据P 值由小到大排列，选取前20 条GO-BP以及KEGG通路进行分析。用Cytoscape 3.8.2软件绘制富集网络图（见图5），通过生物信息在线作图网站微生信绘制GO-BP与KEGG通路富集分析条形图（见图6、表4）。经分析，SYXB治疗DKD的生物过程主要通过调节脂多糖、细菌、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、脂质、活性氧、无机物、金属离子以及对外界的反应，调控DNA结合转录因子的活性，针对细胞进行氧化应激反应；可能与白细胞介素-17（IL-17）信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞凋亡、MAPK信号通路、Th17细胞分化通路等相关。

I：GO-BP 前20 条通路网络图

图5 SYXB-DKD 关键靶点富集分析通路网络图

图6 SYXB-DKD 关键靶点富集分析通路条形图

表4 KEGG 前20 条通路条目

2.6 “SYXB-DKD-通路”网络图

将SYXB药物成分、活性化合物、重合靶点、关键靶点、KEGG通路信息通过Cytoscape 3.8.2 软件构建网络图（见图7）。

图7 SYXB-DKD-通路网络图

3 讨 论

DKD是糖尿病常见的微血管并发症，主要包括肾小球肥大、系膜基质增生、基底膜增厚、肾间质纤维化及肾动脉硬化等病理学改变，其发病机制可能与遗传、血流动力学紊乱、脂代谢异常、氧化应激、炎症因子等相关[10]。西医常规治疗包括降糖降脂、抗炎、控制血压等，并调整生活方式及饮食习惯，但临床治疗效果欠佳[11]。

根据DKD疾病特点与临床症状，中医学将其归属于“关格”“肾消”“水肿”等范畴[12]。国医大师张琪教授认为脾肾两虚、湿热蕴结是DKD的基本病机，贯穿DKD疾病发生发展整个过程[13]。本病虚实夹杂，属本虚标实之证，故治以通补兼施，祛邪与扶正兼顾，补脾肾、泄湿浊，补泄一方，扶正不留邪，祛邪不伤正，方能使病情趋于稳定[14]。在糖尿病肾病的绵长病程中会出现尿浊、水肿等一系列症状，《医碥》云“精、髓、乳、汗液、津、泪、溺，皆水也，并属于肾”。肾虚，封藏失司，精微外泄，故见尿浊；《医门法律》指出“肾者，胃之关也。肾司开合，肾气从阳则开，阳太盛则关门大开，水直下为消；肾从阴则合，阴太盛则关门常合，水不通而为肿”。五脏之衰，久必及肾，肾失气化，发为水肿。SYXB方中黄芪、党参健脾益气，熟地黄、枸杞滋阴补肾，四者共为君药；菟丝子、女贞子、山药健脾益肾为臣药；佐以清热利湿之土茯苓、薏苡仁、白茅根；益母草活血祛湿，芡实固精收涩为使药。诸药共奏健脾益肾、清热利湿之功。

现代药理研究表明，SYXB可以通过上调podocin、nephrin、α-actinin-4、podocalyxin 及ZO-1水平来降低尿蛋白排泄率，调节脂代谢，从而延缓DKD的进展[15]。IL-17 信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、AGE-RAGE信号通路、Th17 细胞分化通路等属于炎症反应相关性通路。炎症反应是DKD的重要反应之一，DKD患者因糖代谢紊乱，刺激肾小球引起血管通透性增加，加速肾脏炎症反应，促使疾病进一步进展[16-17]。Milas O等[18]研究表明，封锁IL-17 信号通路可减轻肾小球损伤和肥大，降低促纤维化相关蛋白表达，减弱糖尿病肾脏中巨噬细胞的积聚，抑制糖尿病肾脏中亲炎和亲纤维基因的表达。IL-17在高血糖条件下发挥着特殊作用，可以促进局部炎症反应，加速DKD进展；使用IL-17中和抗体对DKD具有保护作用[19]。Toll样受体信号通路参与免疫调节与炎症反应，该通路中TLR2/4通过激活MyD88及NF-κB以诱导相应炎症因子转录[20]。TNF信号通路与细胞的生长、分化、凋亡、炎症及免疫调节息息相关，通路中主要因子TNF-α可刺激诱导炎症因子增加，引起胰岛素抵抗，并且能诱导NADPH氧化酶引起氧化应激反应[21]。AGE-RAGE信号通路在DKD中起重要作用，既能激活NF-κB与NADPH氧化酶从而引发氧化应激反应，同时也能刺激血管内皮生长因子增强转化生长因子-β1（TGF-β1）表达[22]。Th17细胞分化通路亦对人体免疫与炎症起调节作用，有研究表明DKD患者体内循环调节性T细胞/辅助性T细胞17（Treg/Th17）为失衡状态，而Treg/Th17失衡也是导致DKD进展的因素之一[23]。

细胞凋亡信号通路、MAPK信号通路属于凋亡-自噬相关性通路。细胞凋亡与自噬均是细胞的正常生理现象，但自噬不足则易导致细胞内溶酶体聚集，促使细胞过度凋亡而引起DKD进一步进展[24]。P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信号转导因子是MAPK信号通路中最重要的一环，既涉及炎症介质的释放，也通过调节肾素-血管紧张素系统从而影响细胞自噬功能[25]。

本研究通过网络药理学方法预测SYXB治疗DKD可能的潜在作用机制，研究表明SYXB具有多成分、多靶点、多通路的特点，中药依据君臣佐使配伍，通过参与多种生物过程及信号通路协同发挥功效，其作用途径可能为参与炎症反应与细胞自噬凋亡进行调节，但本研究无法代替动物实验及临床研究中药物代谢的过程，需进一步进行实验证实。