抑制LncRNA PANDA表达对人心脏瓣膜间质细胞钙化的改善作用及其机制

凌秋洋，赵苗茁，王广涛，杨志宏，刘叶红，叶挺，宗刚军

1 中国人民解放军海军青岛特勤疗养中心老年病康复科，山东青岛 266000；2 中国人民解放军海军第九七一医院心内科；3 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院心内科

随着人口老龄化进程加快，我国已成为心脏瓣膜病高发国家，据统计我国现有心脏瓣膜病患者约2 500万［1］。实验研究表明，心脏瓣膜钙化为主动性、进行性过程，与细胞凋亡、细胞基质改变、细胞炎症反应等密不可分［2］。长链非编码RNA（LncRNA）是一类缺少蛋白质编码功能的RNA，位于细胞核内，长度超过200 bp，自身无开放阅读框架，具有一定的保守性［3］。LncRNA虽然不编码蛋白质，但在生物体内参与组蛋白修饰、基因沉默、转录调节，与肿瘤的发生密切相关。LncRNA还参与调控细胞钙化与炎症反应，与心血管疾病的发生与发展密不可分［4］。LncRNA PANDA是一种转录因子，位于CDKN1A基因转录起始位点上游约5 kb处，可直接诱发细胞凋亡与细胞炎症反应的发生［5］。2022年3月—12月，本研究探讨了抑制LncRNA PANDA表达对人心脏瓣膜间质细胞（hVICs）钙化及细胞凋亡、炎症反应相关因子的影响，为探讨心脏瓣膜钙化的相关机制及其治疗提供新的方向。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：hVICs购自美国DV公司。主要试剂：间质细胞培养基购自美国DV公司，β-甘油磷酸、L-抗坏血酸、地塞米松、重组碱性磷酸酶均购自美国Sigma公司，核酸转录因子YA（NF-YA）、凋亡相关蛋白Bax、锚定蛋白2（Notch2）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）检测试剂盒均购自英国Abcam公司，BMP-2蛋白检测ELISA试剂盒购自美国R&D公司，TRIzol试剂、逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自美国Sigma公司。PANDA-siRNA引物经上海GenePharma公司设计、合成，上游引物：5'-CAGUUACCUGAUAGGCACTT-3'，下游引物：5'-UGGAUACUCAUGUACGUGTT-3'。

1.2 细胞分组及钙化诱导干预处理方法 取hVICs经37 ℃水浴加热，缓慢加入间质细胞培养基10 mL，4 ℃条件下1 200 r/min离心5 min。吸除上清，加入间质细胞培养基2 mL混匀并测定细胞计数。置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2～3 d更换一次培养液。取传至5代的hVICs，以1×105/mL的细胞密度接种在6孔板上，分为正常对照组、钙化组和PANDA-siRNA组。正常对照组加入间质细胞培养基+10%胎牛血清，培养7 d。钙化组加入钙化诱导液进行钙化培养，包括β-甘油磷酸（5 mmol/L）300 µL/孔，L-抗坏血酸（50 µg/mL）200 µL/孔，地塞米松（100 nmol/L）100 µL/孔，重组碱性磷酸酶（50 ng/mL）100 µL/孔，培养7 d。PANDA-siRNA组使用无抗生素培养基进行培养，加入钙化诱导液，培养3 d；待细胞密度达到60%时，采用Lipofectamine™3000转染试剂盒转染PANDA-siRNA，每天进行换液，培养4 d。

1.3 细胞LncRNA PANDA检测 采用实时荧光定量PCR法。取三组细胞，加入TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录为cDNA。以cDNA作为模板加入LncRNA PANDA引物，以β-actin为内参，检测LncRNA PANDA表达。LncRNA PANDA引物序列：上游引物5'-TCCCAACAAACAAGGGGTGG-3'、下游引物5'-GTGGCCAAAGGATCTGACGA-3'；β-actin引物序列：上游引物5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'、下游引物5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。采用2-ΔΔCt法计算LncRNA PANDA相对表达量。

1.4 细胞形态观察 取三组分组培养7 d的细胞，使用光学显微镜观察细胞形态。

1.5 细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白检测采用Western blotting法。取三组分组培养7 d的细胞，加入细胞裂解液裂解，提取总蛋白，测定蛋白浓度。10 000 r/min进行离心5 min，取上清加入上样缓冲液，制备聚丙烯酰胺凝胶，将待测样品加入槽内，在80 V电压下电泳2 h。将电泳分离出的蛋白转入PVDF膜，室温环境下加入5%脱脂牛奶封闭1 h。清洗PVDF膜后，加入NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2及内参β-actin一抗（稀释比例均为1∶ 500），4 ℃孵育过夜；再次清洗PVDF膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比例均为1∶ 5 000），室温孵育1 h。进行抗体标记后曝光显影，Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.6 细胞上清液BMP-2蛋白检测 采用ELISA法。收集三组分组培养7 d的细胞上清液，每组设3个复孔，每孔加样本50 µL，室温孵育2 h，进行3次洗板。每孔加BMP-2抗体200 µL，避光条件下室温孵育2 h，清洗后加200 µL底物，避光条件下室温孵育30 min。加入终止液后，使用全自动酶标仪检测450 nm波长下的光密度值，根据相应标准曲线计算BMP-2蛋白水平，严格按照BMP-2蛋白检测试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料采用S-W正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组细胞LncRNA PANDA相对表达量比较正常对照组、钙化组、PANDA-siRNA组细胞LncRNA PANDA相对表达量分别为14.62 ± 3.21、22.23 ± 2.18、5.12 ± 1.22，组间两两比较P均＜0.05。

2.2 三组细胞形态比较 PANDA-siRNA组细胞结构清晰，呈条索状生长，生长稍缓慢；钙化组细胞成骨样改变，细胞聚集，呈网状结构；正常对照组细胞贴壁生长，生长迅速。见OSID码图1。

2.3 三组细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量比较 与正常对照组比较，钙化组细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量均升高，PANDA-siRNA组均降低（P均＜0.05）。见表1、OSID码图2。

表1 三组细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量比较（）

表1 三组细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与钙化组比较，#P＜0.05。

组别PANDA-siRNA组钙化组正常对照组BMP-2 145.95 ± 21.43*#578.94 ± 45.67*293.52 ± 29.14 NF-YA 140.24 ± 20.71*#580.34 ± 50.81*377.12 ± 30.52 Bax 130.91 ± 18.72*#620.52 ± 58.74*290.37 ± 29.92 Notch2 181.42 ± 22.73*#550.87 ± 40.26*307.56 ± 28.82

2.4 三组细胞上清液BMP-2蛋白水平比较 正常对照组、钙化组、PANDA-siRNA组细胞上清液BMP-2蛋白分别为（42.37 ± 5.42）、（90.59 ± 8.23）、（20.16 ± 2.72）pg/mL，组间两两比较P均＜0.05。

3 讨论

近年来，主动脉瓣膜钙化及主动脉瓣膜狭窄的发病率呈逐年上升趋势，越来越多的老年患者因重度主动脉瓣狭窄而发生心力衰竭。随着经导管瓣膜置换术的推广，重度主动脉瓣膜狭窄等疾病的治疗也取得突破性进展，关于钙化性主动脉瓣疾病发生机制的相关研究越来越多［6-7］。hVICs是心脏瓣膜的重要构成细胞，在心脏瓣膜钙化的发生发展中起到至关重要的作用［8］。hVICs发生炎症、凋亡等均会诱发其成骨样改变，这是导致心脏瓣膜钙化的主要原因，其过程也受到多种基因的表达调控。

随着LncRNA在心血管领域相关机制研究的不断深入，我们逐渐认识到LncRNA可以编码不足100个氨基酸的微肽，这些微肽广泛参与hVICs的炎症反应与成骨样改变［9-10］。LncRNA PANDA是LncRNA HOTAIR之后，被证实参与hVICs钙化的LncRNA之一［11-12］。本研究结果显示，与正常对照组相比，钙化组LncRNA PANDA表达升高并发生成骨样改变；而PANDA-siRNA组LncRNA PANDA表达降低，细胞成骨样改变减轻；这说明在主动脉瓣的钙化过程中，细胞LncRNA PANDA表达升高，而降低LncRNA PANDA表达可减轻其钙化程度［13］。

研究显示，LncRNA PANDA通过miR-27a-3p/叉头盒蛋白O1（FoxO1）而抑制hVICs的增殖，使下游组织金属蛋白酶抑制因子（TIMP）表达升高，导致炎症反应增加，反复刺激hVICs与心脏瓣膜内皮细胞基质碎裂化，抑制细胞泛素化与细胞降解，诱发细胞铁死亡的发生［14］。NF-YA为三聚体复合物，可与细胞表面死亡受体结合而发挥作用。当LncRNA PANDA被敲除后，NF-YA在基因交互中作用减弱，细胞凋亡现象也随之减少［6］。NF-YA存在三个亚基，其中大亚基A的作用是介导细胞炎症反应，小亚基B可以激活凋亡相关蛋白Bax，从而促进细胞凋亡［15］。Notch蛋白是跨膜蛋白受体超家族，其活化与Bax蛋白表达及NF-YA的小亚基C作用相关［16］。NF-YA可直接促进转录因子p53结合到Notch2的启动子区域，从而促进Notch2表达［17］。另一方面，细胞炎症反应、凋亡小体的形成促进了凋亡相关蛋白Bax表达，活化Notch2蛋白，并通过NF-κB途径、JAK/STAT途径等促进hVICs分泌BMP-2，使其向成骨细胞转化，加速瓣膜钙化的进程［18］。BMP-2为细胞分泌型蛋白，可在细胞培养液及血清中被检测到，目前常用的检测方法为ELISA法。血清BMP-2水平越高提示心脏瓣膜钙化程度越重，可使用该指标对钙化性主动脉瓣疾病的病情进行预测评估［19-20］。本研究结果显示，钙化后的hVICs NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2表达升高，而抑制LncRNA PANDA表达的hVICs NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2表达降低；这说明LncRNA PANDA减轻hVICs钙化的机制可能与调控细胞凋亡和炎症反应有关，但具体的通路仍需进一步探讨，这也提示LncRNA PANDA有可能成为治疗钙化性主动脉瓣膜病的潜在靶点，为未来钙化性主动脉瓣膜病治疗药物的研发提供了新思路。