补肺汤治疗慢性阻塞性肺疾病的作用机制探讨

焦玉洁，高智星，张晓谊

乌鲁木齐市中医医院呼吸与危重症医学科，乌鲁木齐 830000

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是目前老年患者中较为常见的慢性疾病，通过针对性制定治疗方案能有效控制病情，而中西医结合治疗COPD已经被证实能更好地控制患者病情发展，降低COPD急性发作的可能［1-2］。中医认为，阳虚痰瘀是COPD的病机，发病根本在于脾阳、肺阳两虚，二者互为影响，而补肺汤是治疗肺脾两虚证的经典方剂。国内已经有研究显示，补肺汤对于COPD具有较好的辅助治疗效果［3-4］。但目前关于补肺汤治疗COPD的有效成分及具体作用机制鲜见报道。2022年11月—2023年1月，本研究采用网络药理学方法分析补肺汤治疗COPD的有效成分及作用靶点，为探讨其具体的作用机制提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 补肺汤的有效成分及作用靶点筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）以及中国天然产物化学成分库中，以补肺汤的组成中药“人参、黄芪、熟地黄、五味子、紫菀、桑白皮”为关键词，通过关键词检索法对有效成分进行初步筛选。同时基于TCMSP，在全网数据库中对补肺汤作用靶点的相关文献进行分析。基于Uniprot数据库，将药物有效成分经过口服利用度和类药性转化后的对应作用靶点与TCMSP数据库搜索的补肺汤作用靶点合并以后删除重复值，得到有效成分作用靶点。

1.2 补肺汤治疗COPD的潜在基因筛选 在Gene Expression Omnibus（GEO）、Drugbank及Genecards数据库中筛选COPD相关表达谱芯片数据集，时间截点为2022年5月，筛选条件为“Chronic obstructive pulmonary disease”，物种选择“human”。利用R语言将GEO数据库对COPD患者与健康人的基因表达谱数据的表达强度归一化。利用R语言limma包筛选出COPD相关靶点，筛选条件：Log Fold Change＞2且P＜0.05。将COPD相关靶点与“1.1”得到的有效成分作用靶点取交集，得到补肺汤治疗COPD的潜在基因。

1.3 补肺汤治疗COPD的主要活性成分筛选 采用拓扑分析法，筛选补肺汤治疗COPD的主要活性成分，基于Cytoscape 3.6. 0（http： //www. cytoscape.org/）软件，建立补肺汤治疗COPD的药物、有效成分及靶点网络相关图，即疾病—药物—主要活性成分—靶点网络图。

1.4 补肺汤治疗COPD潜在基因的功能及相关信号通路分析 ①GO功能分析：对“1.2”中得到的补肺汤治疗COPD的潜在基因进行GO功能富集分析，从生物学过程、细胞组分以及分子功能三个层面分析其功能，取P＜0.05且P值最小排序的前10个结果。②KEGG信号通路分析：将“1.2”中得到的补肺汤治疗COPD的潜在基因输入DAVID 6.8在线分析网站，而后对其进行KEGG信号通路分析，分析结果输入R语言中，采用ggplot2包筛选出P＜0.05且相关性较高的信号通路。

1.5 作用靶点筛选 将补肺汤作用靶点以及COPD相关靶点输入STRING数据库，构建蛋白互作网络（PPI）图，剔除无相互作用的孤立蛋白，筛选标准：蛋白间相互作用得分＞0.4，筛选作用靶点。构建最终的PPI图，并进行可视化处理，建立最终能反映补肺汤治疗COPD的PPI图。

2 结果

2.1 补肺汤的有效成分及作用靶点筛选结果 补肺汤的有效成分初步筛选出738种，其中人参210种、黄芪185种、熟地75种、五味子97种、紫菀63种、桑白皮108种；经过口服利用度和类药性筛选后获得人参的有效成分40种、黄芪27种、熟地9种、五味子19种、紫菀22种、桑白皮36种；其中，槲皮素、黄芪异黄烷苷、山奈酚、异鼠李素、刺芒柄花素、β-谷甾醇、谷甾醇、原阿片碱、3，9 -二甲氧基紫檀烷、7-甲基醚—青榆烯C为重要性排名前10位的有效成分，见表1。筛选得到有效成分的作用靶点141个。

表1 补肺汤重要性排名前10位的有效成分

2.2 补肺汤治疗COPD的潜在基因筛选结果 在GEO、Drugbank及Genecards检索后共收集到1 730个COPD相关靶点，与2.1筛选得到的141个有效成分作用靶点取交集，共得到补肺汤治疗COPD的潜在基因80个。韦恩图见OSID码图1。

2.3 补肺汤治疗COPD的主要活性成分筛选结果 槲皮素、黄芪异黄烷苷及山奈酚等成分可能是补肺汤治疗COPD的主要活性成分。疾病—药物—主要活性成分—靶点网络图见OSID码图2。

2.4 补肺汤治疗COPD潜在基因的GO功能分析结果 从生物学过程、细胞组分以及分子功能三个层面，共计筛选出30个排名靠前的差异显著富集条目，主要涉及炎症反应、细胞凋亡、细胞增殖、氧化还原等。见OSID码图3。

2.5 补肺汤治疗COPD潜在基因的KEGG信号通路富集分析结果 共富集得到20条差异显著的信号通路（P均＜0.05），其中排名前10位的分别是细胞衰老途径、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、细胞周期循环途径、神经营养蛋白信号通路、细胞凋亡途径、Th17细胞分化途径、FoxO信号通路、PI3K/AKT信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路。见OSID码图4。

2.6 补肺汤治疗COPD的作用靶点筛选结果 筛选后作用靶点包括丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90AA1）、禽肉瘤病毒17的转化基因（JUN）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）、cAMP依赖性蛋白激酶α催化亚基（PRKACA）、肿瘤蛋白53（TP53）、雌激素受体1（ESR1）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK14）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。PPI图见OSID码图5。

3 讨论

COPD属于中医“喘症”“肺胀”范畴，对于其稳定期患者常见证型是肺肾两虚证，其临床表现为气喘憋气、动则加重、气不得续、腰膝酸软、咳嗽咳痰。临床上多选用补肺汤主治肺肾两虚证COPD，该方出自《永类灵方》，主要功效是补肺益气、纳肾平喘、止咳化痰。方中人参为君药，可益气、补五脏之气；黄芪归脾经，补气健脾生气；熟地归肾经，可补肾气；五味子归肝经，可酸温敛肝、疏肝气；紫菀归肺经，为肺经引经药物，可敛肺止咳；桑白皮归肺经，泻肺平喘，利水消肿。六味药物协同，可达到补肺纳肾、益气止咳平喘之功，有助于提升COPD患者的肺功能，改善临床症状，提高生活质量。网络药理学是从系统水平角度出发，基于网络观点分析药物种类、具体化学成分、作用靶点之间关系的研究策略，该方法与中医的整体观点类似［5-6］。目前国内外有大量研究使用该方法对单味药物及药方进行研究，有助于深入地了解中药治疗疾病的具体作用机制［7-8］。研究显示，补肺汤能降低气道炎症反应，减少局部气道痰液分泌，提升免疫功能，增强抵抗力，对于COPD具有一定的辅助治疗作用［9］。但目前关于补肺汤治疗COPD的有效成分及作用靶点尚未可知。

本研究通过网络药理学的方法，从补肺汤的6味中药中获取了141个有效成分，在建立拓扑分析网络后发现，槲皮素、黄芪异黄烷苷及山奈酚等成分可能是本方发挥作用的主要活性成分，其中槲皮素、黄芪异黄烷苷、山奈酚、异鼠李素、刺芒柄花素均是类黄酮化合物。研究显示，黄酮类化合物可以通过降低NF-κB通路中κB蛋白、IκB激酶及MAPK通路中ERK、p38蛋白表达，从而抑制上述通路参与的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1及IL-6等炎症因子激活，最终减轻COPD气道重塑，避免病情进展［10-11］。本研究发现，人参的重要成分原阿片碱也是对COPD作用较显著的成分之一，但目前临床上对于阿片类药物应用于COPD的治疗尚存在一定争议，故需要进一步研究予以证实［12］。β-谷甾醇及豆甾醇均属于醇类化合物，可通过抑制黄酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）激活，减少STAT信号表达，进而导致干扰素刺激基因因子3（ISGF3）复合物的转录活性降低，最终使得干扰素致敏细胞促炎症放大作用减弱，发挥降低COPD气道局部炎症的作用［13-14］。

从本研究GO功能富集分析结果可以推测，补肺汤治疗COPD并非单一途径或单一作用点，而其中主要途径还是控制炎症反应。本研究KEGG分析结果显示，细胞衰老是导致慢性肺部疾病发生的主要病因。BARNES等［15］研究显示，COPD等慢性肺部疾病可以激活p53和p16INK4a，从而激活p21CIP1，并导致细胞周期停滞，是导致细胞衰老的主要原因。氧化应激反应也是引发细胞衰老的关键因素，会导致炎症反应进一步加剧，而补肺汤中的人参及半夏均被证实对于抑制细胞衰老、改善细胞周期具有一定作用［16-17］。研究显示，NF-κB和FoxO在COPD患者血清中高表达，而NF-κB可以促进FoxO激活，从而导致肺支气管壁中的微结构发生自噬，引起气管壁细胞凋亡［18］。补肺汤中的主要成分对于NF-κB通路具有抑制作用，因此对于FoxO表达也有一定的抑制作用。Rap1/Ras/PI3K/AKT通路是诱导细胞凋亡的主要途径，还能促进IL、TNF、干扰素等炎症因子生成，同时上述传导通路相互影响，从而构建起炎症反应关系网，进一步促进局部炎症反应增加，最终导致COPD的病程进展［19-20］。Th17/Treg平衡是影响体内炎症反应的重要因素，而Th17细胞分化是导致Th17/Treg平衡改变的主要因素之一。研究显示，补肺汤中人参的主要成分人参皂甙对于Th17/Treg平衡具有重要影响［21］。本研究结果显示，Th17细胞分化是补肺汤影响COPD的途径之一，但具体作用机制尚未可知，可以作为今后的研究重点。

在本研究最终建立的PPI图中，补肺汤的作用靶点包括MAPK1、HSP90AA1、JUN、EGFR、TNF、PRKACA、TP53、ESR1、MAPK14、MAPK8。正如之前所述，补肺汤中的类黄酮物质及β-谷甾醇等对MAPK表达具有抑制作用，PPI图显示MAPK1、MAPK8、MAPK14正是补肺汤的作用靶点。TNF是介导体内炎症反应的重要基因，其中TNF-α是导致IL释放并促使局部炎症反应加重的重要原因。研究显示，补肺汤能降低COPD患者血清TNF-α水平，说明TNF可能是补肺汤的主要作用靶点［22］。HSP90AA1是热休克蛋白家族成员之一，其在COPD患者体内表达发生改变，还能影响单核细胞内TNF的释放，从而影响局部炎症反应［23］。PRKACA、JUN、EGFR、TP53、ESR1是参与影响细胞增殖过程的重要基因。研究显示，在COPD的病理改变过程中，成纤维细胞增殖是气道重塑的重要原因［24］。本研究结果显示，补肺汤可能通过抑制PRKACA、JUN、EGFR、TP53、ESR1表达，来阻止成纤维细胞增殖，从而达到抑制气道重塑的作用，但其具体机制仍需要进一步明确。

综上所述，补肺汤治疗COPD的有效成分是槲皮素、山奈酚等，可能通过MAPK1、HSP90AA1、JUN等作用靶点调控细胞衰老途径、MAPK信号通路、细胞凋亡途径等而发挥作用。本研究通过网络药理学方法对补肺汤作用于COPD的具体机制进行了较为详尽的分析，利用有效成分、基因及作用途径等客观数据对补肺汤的作用机制进行了阐述，为开展实验室研究提供了有效的参考，便于今后临床进一步对补肺汤开展动物或人体实验。