基于细胞焦亡探讨中医药防治糖尿病及其并发症的研究进展

王瑞楠,孙艺,韩宇博 刘莉

细胞焦亡的相关研究最早始于20世纪80年代,Friedlan-der[1]发现利用炭疽致死毒素处理小鼠腹腔巨噬细胞,不仅促进了细胞裂解死亡,还诱发了炎性反应。几年后,研究人员通过对感染福氏志贺菌的巨噬细胞进行研究,发现了这种由半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)介导的促炎性细胞死亡途径[2]。2001年Cookson等[3]将这种细胞死亡方式命名为Pyroptosis即细胞焦亡。随着细胞焦亡在医学领域受到的关注逐渐增多,越来越多的证据证实细胞焦亡与代谢性疾病、肿瘤、心血管疾病等各类疾病密切相关[4-6]。

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以代谢失调和慢性炎性反应为主要特征的免疫性疾病,由于其常伴随一些严重的并发症,始终是医疗界的一个核心问题。研究发现高血糖会导致糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高,诱导炎性小体激活进而发生细胞焦亡,细胞焦亡或许将成为防治DM及其并发症的新切入点[7-8]。中医药调控细胞焦亡具有多靶点、多通路等独特优势,故笔者从细胞焦亡的角度出发,对细胞焦亡的机制、通路以及中医药通过调控细胞焦亡防治DM及其并发症的研究进展情况做系统综述,以期为今后中医药防治DM及其并发症提供理论依据并扩宽思路。

1 细胞焦亡概述

细胞死亡是最基本的生物学过程,细胞死亡方式主要分两种,一种是细胞坏死,另一种是包括凋亡、自噬、焦亡在内的程序性死亡[9]。细胞焦亡过程中,细胞膜表面会出现大量的孔隙,导致细胞肿胀和破裂的发生,与此同时细胞内容物流出,进而造成持续的炎性反应。细胞焦亡在心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等各类细胞中均会发生,其过程主要依赖于Caspase家族的活性[10]。根据细胞焦亡被激活的途径不同可以分为依赖Caspase-1激活的经典途径和依赖Caspase-4/5/11激活的非经典途径。

2 细胞焦亡途径

2.1 经典细胞焦亡途径 经典的细胞焦亡途径主要依赖Caspase-1的激活。当细胞受到如高血糖、炎性反应等因素的刺激时,会激活炎性小体的传感器,其包括核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NOD-like receptors,NLRs)、黑色素瘤缺乏因子2样受体(absent in melanoma 2 like receptors, ALRs)以及Toll样受体(Toll-like receptors,TLR),NLRP3是其中最常见的一种[11]。通过识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs) 或危险相关分子模式(danger-associated molecular pattern, DAMPs)激活相应的炎性小体,被激活后的炎性小体通过凋亡相关斑点蛋白(ASC)将自身与pro-Caspase-1结合并激活Caspase-1,激活的Caspase-1可以活化pro-IL-1β以及pro-IL-18,使其成为成熟的炎性细胞因子,诱发炎性反应[12]。与此同时活化后的Caspase-1通过特异性切割Gasdermin D(GSDMD),产生具有活性的带有N端片段的GSDMD-N,GSDMD-N能够与质膜结合,并形成许多直径10～20nm的孔洞,孔洞的形成会促进炎性因子的释放进而放大炎性反应,细胞内外渗透压改变,最终细胞肿胀破裂,发生细胞焦亡[13]。

2.2 非经典细胞焦亡途径 非经典的焦亡途径主要依赖脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导。革兰阴性细菌中的LPS能够直接激活人类的Caspase-4、Caspase-5以及小鼠的Caspase-11[14],激活的 Caspase-4/5/11可以特异性切割 GSDMD,释放GSDMD-N诱导细胞焦亡;同时GSDMD-N会激活NLRP3炎性小体,并诱导Caspase-1活化进而激活经典途径的细胞焦亡[15]。在这个过程中,活化的Caspase11可直接裂解缝隙连接蛋白-1(Pannexin-1),促进钾离子外排并将ATP释放到细胞外,导致细胞膜破裂,最终发生细胞死亡。

3 细胞焦亡与糖尿病及其并发症

3.1 细胞焦亡与糖尿病 文献报道,2022年全世界有约5.37亿成年DM患者,且患病率仍在不断上升,已成为世界范围的严重公共卫生为题[16]。炎性反应与DM有着密不可分的关系。1型糖尿病(T1DM)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征是胰岛素缺乏和由此导致的高血糖。Ma等[17]发现细胞焦亡促进了β细胞的破坏,进一步损伤了胰岛功能。Carlos等[18]在链脲佐菌素诱导的T1DM小鼠模型中,观察到小鼠胰腺组织的NLRP3和IL-1β水平明显升高;相反,NLRP3基因敲除的小鼠不仅NLRP3和IL-1β水平明显降低,其胰岛素水平也显著提高,可见NLRP3介导的细胞焦亡参与了T1DM的发展进程。此外,还有研究指出过高的AGEs水平会损伤β细胞功能,减少细胞数量[19]。在此基础上,通过干预AGEs积累水平能够降低小鼠T1DM的发病率,AGEs或许是防治T1DM的潜在靶点。

2型糖尿病(T2DM)的病理基础是胰腺β细胞功能障碍和胰岛素抵抗,大量证据表明细胞焦亡与肥胖和胰岛素抵抗密切相关。DM初期的代谢产物如磷脂酶C、二酰巯基乙醇会活化蛋白激酶C,最终激活NLRP3炎性小体,引起细胞焦亡发生;而随着病情的进展,细胞焦亡会进一步导致β细胞数量减少,并且加重胰岛素抵抗[20]。在动物模型中发现,高脂饮食(HFD)诱导的小鼠脂肪组织中,NLRP3、IL-1β及IL-18表达水平明显提高,胰岛素敏感性降低;之后研究者将收集的T2DM患者腹部活检数据进行分析,最终得出结论,即T2DM患者通过减重及减少摄入后,其脂肪组织 NLRP3和炎性因子表达降低,且胰岛素敏感性得到改善,这恰恰证实NLRP3在肥胖及胰岛素抵抗的发展过程中发挥着至关重要的作用[21]。Sehgal等[22]也印证了这一观点,数据显示NLRP3炎性小体促进了脂肪组织炎性反应的发生,降低了胰岛素的敏感性,并且NLRP3炎性小体、Caspase-1、IL-1β的表达水平与胰岛素抵抗的严重程度直接相关。肝脏胰岛素抵抗是T2DM发展关键环节,研究表明肝胰岛素信号通路受损、线粒体自噬和NLRP3炎性小体活化与肝脏胰岛素抵抗密切相关[23]。此外,骨骼肌是胰岛素的靶器官之一,Cho等[24]在一项体外研究中发现,脂滴包被蛋白2(PLIN2)的过表达在激活NLRP3炎性小体,提升Caspase-1、IL-1β表达水平的同时,还能够抑制胰岛素诱导的葡萄糖摄取,降低胰岛素受体底物IRS-1的表达,说明NLRP3炎性小体、IL-1β对骨骼肌细胞IR具有一定调控作用。

总之,细胞焦亡过程中伴随的大量炎性因子释放是其参与DM发生发展的核心机制,NLRP3炎性小体和炎性因子发挥了重要的作用,由此可见,通过靶向细胞焦亡的相关分子进而防治DM可能是一种有效途径。

3.2 细胞焦亡与糖尿病并发症 糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的患病率和病死率较高,其最主要特征是心脏结构的改变和功能的异常,最终进展为心力衰竭[25]。心肌细胞死亡、心肌细胞肥大及纤维化均会加重心室重构,也是导致DCM进展的罪魁祸首。Cao等[26]发现,NLRP3炎性小体和细胞焦亡加剧了H9C2心肌细胞损伤,NLRP3炎性小体和细胞焦亡与DCM密切相关。在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型中,其心脏组织AIM2表达显著增加,并且大鼠表现出严重的左心室功能障碍,包括代谢紊乱、心脏纤维化和心肌细胞死亡。之后的体外实验中,通过AIM2的基因沉默改变了上述结果,最终得出结论,AIM2通过GSDMD介导的细胞焦亡途径在糖尿病性心肌病的细胞死亡和纤维化中发挥重要作用[27]。另有研究报道,在高糖诱导的DCM心肌细胞中,活化的Caspase-1和焦亡细胞因子可通过AMPK-TXNIP通路诱导心肌细胞焦亡[28]。

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的并发症之一,是一种无菌性的炎性疾病。近年来,大量的研究结果表明,细胞焦亡在DN的发展过程的作用尤为重要。在STZ诱导的DN小鼠模型中,Caspase-1、NLRP3和IL-1β的表达水平显著增高[29],为细胞焦亡促进DN进展的理论提供了有力的证据。Shahzad等[30]发现线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)及NLRP3炎性小体的激活会加重DN的肾脏损害。在高糖培养的足细胞中,Caspase-11、Caspase-4、GSDMD-N、IL- 1β和IL-18水平提升,而Nephrin和Podocin蛋白的表达被抑制,因此研究者认为Caspase-11/4和GSDMD介导的细胞焦亡参与了足细胞损伤和DN的发展。在其他的研究报道中, TXNIP和炎性小体相关通路激活在DN进展中的作用也逐渐被认可[31]。

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是全球成人视力受损及失明的最主要原因之一[32]。研究发现DR患者玻璃体样本中NLRP3、Caspase-1、ASC和IL-18的表达水平升高,这一现象在增殖性糖尿病视网膜病变 (PDR)患者的玻璃体样本中更为直观,提示NLRP3可能与PDR的发病机制密切相关[33]。Hao等[34]指出,NLRP3炎性小体激活增加了血液—视网膜屏障的通透性,其诱发和加重的炎性反应是参与DR各个病理阶段的主要机制。

糖尿病周围神经病变(diabetic pripheral neuropathy,DPN)是最常见的糖尿病并发症,高血糖诱发的氧化应激和炎性反应发生,导致了周围神经病变的出现。研究发现褪黑激素通过靶向miR-214-3p/Caspase-1轴抑制神经元细胞焦亡,从而起到保护神经的作用[35]。上述研究表明,细胞焦亡介入了糖尿病并发症的发生和发展,针对NLRP3炎性小体及相关激活通路的治疗研发具有无限潜能。

4 中医药对细胞焦亡的影响及其在糖尿病防治中的应用

中医学理论强调整体观念,《素问·生气通天论篇》记载:“阴平阳秘,精神乃治,阴阳离决,精气乃绝”,阴阳维持平衡才能保证人体正常的生命活动。细胞焦亡在本质上与人体阴阳相似,细胞焦亡“过盛”或“过衰”都会打破平衡引发疾病,而DM则是细胞焦亡过盛所致的结果。

4.1 中药单体 人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1,GRb1)主要提取自人参、西洋参等的根、茎,由于其具有调控血糖,改善胰岛素抵抗的作用,临床常用于防治糖尿病及其并发症[36]。张翕宇等[37]研究发现,GRb1能够通过NLRP3/ GSDMD通路来抑制胰岛细胞焦亡的发生。在高糖诱导的胰岛素瘤细胞中,GSDMD 表达水平显著增加,IL-1β释放增多,并可明显观察到细胞肿胀等焦亡现象的出现。GRb1能够抑制大鼠胰岛素瘤细胞焦亡,下调NLRP3水平,抑制GSDMD表达,减少IL-1β释放,从而保护胰岛细胞功能,减轻炎性反应,发挥防治糖尿病的作用。大黄素是一种游离蒽醌类化合物,具有抗炎、抗氧化等主要作用。研究表明,大黄素可以抑制炎性因子IL-1β释放及炎性小体NLRP3的激活,并抑制随后出现的GSDMD裂解,防止INS-1细胞焦亡的发生[38]。不仅如此,过表达的NLRP3能够逆转大黄素的保护作用,因此得出结论:大黄素通过靶向NLRP3/GSDMD轴来调控高糖状态下诱导的细胞焦亡,发挥治疗DM的作用。雷公藤具有抗炎、抗氧化应激等生物活性[39],研究发现雷公藤多苷可显著降低糖尿病肾病模型大鼠的血清IL-1β、IL-18水平,延缓肾脏组织病理改变,并抑制NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达水平[40]。其改善炎性状态、减轻肾脏病理损伤的机制与抑制NLRP3炎性小体激活进而调控细胞焦亡通路相关蛋白表达及炎性因子释放密切相关。此外,研究证实大蒜素能够通过抑制ROS/ NLRP3/ Caspase-1通路活化,进而改善肾组织细胞焦亡[41]。董雯等[42]通过构建肥胖小鼠认知障碍模型,发现白藜芦醇可降低海马组织中NLRP3的激活水平,同时抑制神经炎性反应的级联效应,从而改善肥胖导致的细胞焦亡,并起到保护认知功能的作用。

4.2 中药复方 黄连温胆汤出自清代《六因条辨》,是临床治疗代谢综合征的经典方剂,具有显著的抗炎、降糖等作用。马伯艳等[43]发现黄连温胆汤含药血清能够通过抑制NLRP3激活的细胞焦亡,改善胰岛素抵抗。通过构建了NLRP3过表达的IR-HepG2 细胞模型,并利用不同浓度的黄连温胆汤含药血清处理,检测IL-1β和IL-18、NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达水平,证实黄连温胆汤含药血清在细胞焦亡中具有抑制炎性因子释放及相关基因表达的作用,为临床中胰岛素抵抗及T2DM的防治提供了新的靶点。黄奡等[44]通过对补脾益肾、活血化瘀法对大鼠肾脏NLRP3/Casepase-1/ GSDMD/ IL-1β信号通路的研究发现,益肾康可有效缓解糖尿病大鼠的肾脏炎性损伤,主要方式是下调NLRP3、Casepase-1、IL-1β及GSDMD的表达水平,从而抑制肾脏细胞焦亡,起到保护肾脏细胞的功效。宋瑞婧等[45]发现加味升降散对DKD大鼠进行4周灌胃,可显著降低大鼠肾组织TXNIP、NLRP3、Caspase-1 表达及炎性因子水平,表现出显著的肾脏保护作用,其机制可能是通过抑制TXNIP/NLRP3轴蛋白表达,进而调控细胞焦亡有关。王美子等[46]通过葛根芩连汤加味方对糖尿病肾病大鼠焦亡及IR影响的研究发现,葛根芩连汤加味方能够有效干预糖尿病肾病损伤大鼠的肾脏细胞焦亡,改善胰岛素抵抗,但具体通路及作用方式,仍待于进一步探究。吴长江等[47]通过建立糖尿病周围神经病变小鼠模型,证实糖络宁能够有效调控糖尿病周围神经病变小鼠的坐骨神经细胞焦亡,实验中糖络宁高剂量组中的焦亡相关因子表达均较模型组明显降低,同时沉默信息调节因子1(SIRT1)表达水平也明显高于模型组,由此可见,糖络宁通过促进SITR1表达,进而抑制坐骨神经细胞焦亡的发生,起到延缓糖尿病周围神经病变的目的。乌梅丸是临床治疗糖尿病的经典处方之一,Yang等[48]经研究发现,乌梅丸治疗自发性糖尿病模型小鼠,连续给药4周,可显著减低小鼠胰岛素抵抗,一定程度逆转了糖尿病小鼠的IL-1β和 IL-18的表达水平,有效抑制NLRP3、Caspase-1等其他焦亡相关分子的表达,从而保护胰岛β细胞,对T2DM发生发展起到预防效果。

5 结语与展望

DM是一种慢性代谢性疾病,其疾病本身及各类并发症始终是全世界学者关注的焦点,细胞焦亡介导的炎性反应在其中发挥着至关重要的作用。通过调控细胞焦亡通路相关蛋白,改善炎性反应的糖尿病防治手段获得了一定成果,大量中药单体以及中药复方均能够通过抑制NLRP3、Caspase-1表达,调控相关焦细胞焦亡通路,发挥防治DM及其并发症的作用,这对于进一步探究细胞焦亡的分子机制,防治及研发特效药物具有深远的意义。

中医药防治DM具有多靶点、多途径的优势,基于细胞焦亡理论,中医药在治疗肿瘤、心血管疾病、类风湿关节炎等疾病均展现出巨大潜力[49-51]。笔者认为,目前中医药防治DM及并发症的研究仍存在几点需要思考的问题。首先,现阶段有关中医药防治DM及并发症的文献有限,大多集中在DM和DN。此外,有关中药复方和中药单体的文献数据来源大多局限于基础实验,针对细胞焦亡通路的研究,也停留在NLRP3、Caspase-1、GSDMD等焦亡相关分子上,深度不足。可结合基因组学、生物信息学等多学科手段,深入挖掘其具体作用机制,利用非编码RNA的调控作用,找到细胞焦亡的上游调控机制是一个可行的思路,这也是本团队的下一步研究方向。

总而言之,中医药在防治DM及并发症中的作用无法替代,未来随着中医药靶向细胞焦亡防治DM及并发症的机制被揭示,相关中药新药的研发必将具有无限光明的前景。