细胞焦亡在卒中及抑郁症中的研究进展

贾春凯, 王 韬综述, 王 荔审校

细胞焦亡(pyroptosis)作为新型促炎性程序细胞死亡类型,通过半胱天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)和NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor3,NLRP3)炎性小体的激活介导发生[1]。激活的炎性小体介导GasderminD(GSDMD)蛋白的裂解,随后发生细胞焦亡[2]。卒中是以骤然发生、迅速发展的局限性或弥散性脑功能缺损为主要临床特点的器质性脑血管病变。卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)表现为心情沮丧、自我认知价值观念下降、睡眠障碍、自杀倾向等,是卒中患者最常见的一种并发症。目前对卒中及抑郁症的病因尚未完全明确。细胞焦亡作为当前中枢神经系统细胞死亡类型的研究热点,通过炎性小体、miRNA等介导途径为卒中及抑郁症的相关研究提供了新的研究思路。本文对细胞焦亡在卒中及抑郁症的发生机制及抑制细胞焦亡在疾病治疗中的应用研究进展做一综述。

1 细胞焦亡的四个途径

1.1 细胞焦亡的经典途径 经典途径中,炎性小体的组装是导致细胞焦亡的关键因素。炎性小体由模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Caspase-1三部分组成。目前最常见的PRR是以NLRP1、NLRP2和NLRP3为主的核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor,NLR)[3]。PRR作为炎性小体的感受器,当被病原体相关分子(PAMP)和损伤相关分子(DAMP)特异性识别后激活。ASC作为炎性小体的结构骨架,是PYCARD基因编码的一类能使PPR偶联效应蛋白酶的非酶支架蛋白。它可以激活Caspase-1前体并将其转化为活跃状态的Caspase-1。当炎性小体组装完成时,激活的Caspase-1可裂解GSDMD蛋白,使GSDMD-N暴露,在细胞膜上形成大小为10～15 nm的膜孔,细胞膜两侧的离子浓度失衡、渗透压改变,是细胞裂解的最主要原因。同时,激活的Caspase-1使活化的IL-1β和IL-18在细胞膜孔中被释放到胞外,诱导随后的炎症反应。激活的Caspase-1能使细胞裂解和炎性介质释放过程独立发生。此外,也有研究表明即使没有激活PPR时,当炎性小体组分(例如NLRP3和ASC)在细胞内高表达时,亦会引起细胞焦亡。

1.2 细胞焦亡的非经典途径 非经典途径与经典途径相比几乎不与相关炎性小体结合而发挥作用。人的Caspase-4/5或小鼠的Caspase-11前体与细菌内毒素的脂多糖(LPS)结合可使Caspase-4/5/11激活。激活后的Caspase-4/5裂解GSDMD蛋白形成具有活性的GSDMD-N,它能使膜孔形成跨膜孔通道进而诱导细胞焦亡发生。另外,Caspase-11与LPS结合,促进跨膜蛋白-1(Pannexin-1,Panx1)激活,释放腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)与胞膜的嘌呤能受体(P2X7)受体结合,触发钾离子及钙离子发生内外交换,形成非选择性细胞膜孔,激活NLRP3-ASC-Caspase-1的细胞焦亡信号通路,随后导致成熟的IL-1β、IL-18等炎症因子释放[4]。研究人员发现志贺毒素/LPS在非典型细胞焦亡途径中,典型途径的NLRP3炎性小体可被该菌株线粒体中裂解的GSDMD蛋白产生的活性氧激活。其次非典型途径中GSDMD蛋白的激活以及典型途径炎性小体的部分激活可能与DAMP在细胞内发挥的作用有关,该过程同时涉及细胞焦亡的经典与非经典途径。

1.3 凋亡相关Caspase蛋白途径 除了以是否通过Caspase-1激活的经典及非经典途径之外,细胞焦亡亦可由一些凋亡性Caspase引发。研究发现化疗药物引起的细胞焦亡,是通过Caspase-3对GSDME进行剪接,形成GSDME-N使细胞膜穿孔而发生的。另有研究发现Caspase-1/3/7对GSDME的切割是诱导硬骨鱼类细胞焦亡的唯一途径。Zheng等[4]认为Caspase-8可以同时裂解 GSDMD和GSDME并释放N端结构域来诱导细胞焦亡,Demarco等[5]发现Caspase-8可通过裂解GSDMD并释放GSDMD-N来触发细胞焦亡。更有Orning等[6]研究表明Caspase-8不但介导细胞焦亡,而且还可以抑制机体的先天性免疫功能。

1.4 颗粒酶(Granzyme)途径 颗粒酶是一种外源的丝氨酸蛋白酶,它是从细胞毒性和自然杀伤细胞中释放出来的。Zhou等[7]发现颗粒酶A可裂解GSDMB,释放GSDMB-N片段,造成细胞膜穿孔,导致表达GSDMB的癌细胞发生细胞焦亡。Zhang等[8]发现颗粒酶B可以直接切割GSDME或间接激活Caspase-3来诱导表达GSDME使得肿瘤细胞发生细胞焦亡。

细胞焦亡与细胞凋亡的发生存在交叉点,GSDMD-N可以激活细胞焦亡经典途径的NLRP3炎性小体,继而促进GSDMD蛋白的切割以及炎症因子释放。且该炎性小体亦参与细胞凋亡过程。细胞焦亡与细胞凋亡之间存在相互转化,研究发现Caspase-3切割GSDME后可以实现此转化过程。若将 GSDMD的裂解位点转化为Caspase-3,亦可介导此转化过程的发生。

2 发生细胞焦亡的中枢神经细胞

2.1 细胞焦亡与小胶质细胞 常驻于中枢神经系统中的小胶质细胞,其作用为调节神经细胞发育、髓鞘修复、神经可塑性,在激活炎性小体中起主要作用。小胶质细胞能表达多种PRR,例如Toll-like受体等,可上调髓系细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)的表达进而识别PAMP和DAMP,通过经典途径介导细胞焦亡[9,10]。神经炎性反应引起的小胶质细胞焦亡与许多神经系统病变(如卒中、抑郁症、神经退行性疾病等)的发病机制密切相关,是细胞发生焦亡的主要细胞类型。Gu等[11]发现在出血性卒中的小鼠模型中,香蜂草甙能显著减少血肿周围组织中的小胶质细胞活化及中性粒细胞的浸润,同时下调细胞焦亡相关分子和神经炎症因子的表达进而改善小鼠神经行为表现。Bora等[12]证明富马酸二甲酯通过降低IL-1β、IL-18、Caspase-1和NLRP3水平,减少活性氧的形成以及抑制核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)途径的N9小鼠小胶质细胞中的细胞焦亡水平来改善LPS引起的抑郁行为。有关学者在体外试验中发现,小胶质细胞能在阿尔茨海默病患者的主要神经毒性成分Aβ纤维作用下分泌ASC及产生依赖性NLRP3的IL-1β炎症因子,从而证实 ASC基因的缺失及抗体的阻滞对Aβ纤维的募集起抑制作用,提示抑制细胞焦亡释放的ASC可能延缓阿尔兹海默病的进展。

2.2 细胞焦亡与星形胶质细胞及神经元 星形胶质细胞中存在炎性小体,如NLRP1、Caspase-1、黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)等。Kir6.1/K-ATP通道(Kir6.1/K-ATP)是星形胶质细胞中表达的代谢性应激传感器。目前已有研究表明,ATP通过结合蛋白激活NLRP2炎性小体在星状胶质细胞中发挥作用。Li等[13]在星形胶质细胞Kir6.1敲除的抑郁症小鼠模型中发现星形胶质细胞Kir6.1的缺失增加了NLRP3炎性小体介导的星形胶质细胞焦亡,认为Kir6.1是细胞焦亡的重要调控环节,在抑郁症中发挥重要作用。研究发现在小鼠模型中星形胶质细胞在LPS、乙醇等刺激后会诱发Caspase-1介导的细胞焦亡。Mckenzie等[14]在神经元用合成的双链DNA试剂激活AIM2炎性小体后可引起大鼠Caspase-1依赖的皮质神经元细胞焦亡。

3 细胞焦亡与卒中

细胞焦亡经典途径过程相关炎性标志物在脑缺血半暗带的中高表达[15,16]。在急性期卒中时,DAMP激活PRR形成炎性小体并触发炎症反应,炎性介质(如IL-1β、IL-18等)释放。小胶质细胞焦亡诱发的神经炎症被认为是导致缺血性卒中后神经元损伤的关键因素。Wang等[17]在大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)的缺血性卒中模型中,发现梗死区周围细胞焦亡水平在急性期卒中显著升高,降低GSDMD水平可有效抑制小胶质细胞分泌成熟型IL-1β和IL-18。在局灶性卒中模型中发现,IL-1和IL-18在小胶质细胞TREM-1和脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SKY)的下游,IL-1和IL-18表达上调伴随GSDMD蛋白高表达,推测TREM-1和SYK是卒中病程中细胞焦亡的上游因子。卒中产生活性氧(ROS)是激活NLRP3炎性小体的中介因子,可加剧卒中的炎症级联反应和细胞损伤。此外,miRNA作为一类小的、单链的、非编码的RNA,参与了自身免疫系统的调控,NLRP3炎性小体的转录后调节与多种miRNA表达相关,相关miRNA激活或抑制可以诱导卒中的细胞焦亡,影响功能恢复。由此可见,细胞焦亡与卒中之间存在紧密的联系。

3.1 NLRP3炎性小体介导细胞焦亡途径与卒中 近年来,随着卒中在NLRP3炎性小体依赖的细胞焦亡途径中相关研究不断深入。Franke等[18]在短暂大脑中动脉闭塞(tMCAO)再灌注的缺血性卒中小鼠模型中发现NLRP3炎性小体诱导急性期卒中的神经炎症。Gu等[19]在小鼠出血性卒中模型中发现Raf激酶抑制剂(RKIP)与ASC结合之后中断NLRP3炎性小体的装配,通过经典途径显著缓解神经元变性,减少膜孔的形成,下调细胞焦亡相关标志物的表达。降低血脑屏障的破坏,促进出血性卒中之后24 h的血肿吸收,从而改善神经功能缺损。Zhang等[20]在大鼠脑缺血/再灌注(I/R)模型中发现天麻素通过下调NLRP3、IL-1β、IL-18等炎症因子和Caspase-1来抑制细胞焦亡。Ma等[21]利用原代小胶质细胞的氧-葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)模型发现丹参酸能抑制小胶质细胞M1表型向M2表型的变化,从而抑制NLRP3炎性小体依赖性的细胞焦亡途径,从而起到神经保护的作用。更有学者在缺血性卒中细颗粒物(particulate matter 2.5,PM2.5)介导的毒性作用研究中发现脑缺血条件下伴随PM2.5暴露可触发NLRP3炎性小体的激活和细胞焦亡,推测可能是由缺血性卒中后产生的ROS所介导的[22]。因此通过抑制NLRP3炎性小体依赖的细胞焦亡途径可以改善卒中的进展。

近来Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及NF-κB已成为通过抑制细胞焦亡途径进而改善卒中的关键一环。Liu等[23]发现在OGD/R处理的BV2细胞模型中,红景天苷通过抑制TLR4/NF-κB信号通路间接抑制小胶质细胞中NLRP3炎性小体的激活,最终抑制BV2细胞焦亡过程和改善卒中诱导的神经元损伤。Wang等[24]发现在局灶性脑缺血大鼠模型中褪黑激素治疗通过调节TLR4/NF-κB信号通路降低了缺血诱导的炎症反应和炎性小体介导的细胞焦亡水平。Li等[25]对MCAO大鼠吲哚布芬或阿司匹林预处理后,联合氯吡格雷或替格瑞洛发现通过NF-κB/NLRP3信号通路介导减少了炎性小体和OGD后PC12细胞的焦亡。Ran等[26]在MCAO后小鼠中发现姜黄素也通过抑制NF-κB/NLRP3信号通路,减少了卒中引起的白质损伤同时减轻了小胶质细胞的焦亡。Luo等[27]认为重复经颅磁刺激(rTMS)通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,间接抑制促炎型M1活化和增强梗死周围抗炎型M2活化,改变小胶质细胞M1/M2表型平衡,来缓解卒中诱导的运动障碍和神经元细胞焦亡。由此可见,通过对TLR4、NF-κB、NLRP3等调控进而抑制细胞焦亡途径来延缓卒中的进展。

3.2 微小RNA(miRNA)介导细胞焦亡途径与卒中 Shi等[28]发现通过敲低miR-155-5p可减轻OGD/R刺激的细胞损伤,减小MCAO大鼠的脑组织梗死面积,抑制细胞炎症和细胞焦亡。增加miR-200a-3p表达可以减轻因细胞焦亡而导致的脑损伤,使用miR-129拮抗剂可以改善神经元细胞焦亡及认知障碍[29]。Wang等[30]发现上调miR-139可以通过负调节c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,c-Jun)/NLRP3炎性小体信号通路对OGD/R诱导的神经损伤发挥神经保护作用。Yao等[31]研究发现人参皂苷在MCAO小鼠模型可上调miR-139-5p,进而抑制调节胰腺β细胞团的关键调控因子(Foxo1)/Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)/Nrf2信号通路,促进NLRP3炎性小体的激活;在卒中后的炎症中,牛磺酸上调基因1(lncRNA Tug1)通过miR-145a-5p/TLR4信号通路促进卒中后NLRP3炎性小体依赖性的细胞焦亡的发生[32]。研究发现长链非编码RNA母系表达基因3(lncRNA MEG3)通过miR-485/AIM2信号通路激活Caspase-1信号传导引起细胞焦亡,从而加速脑缺血的再灌注损伤。神经干细胞程序性死亡是卒中后神经再生的不利因素之一,有学者研究发现高压氧治疗[33]一方面增加OGD后的神经元生成,另一方面通过lncRNA-H19/miR-423-5p/NLRP3信号通路减弱神经干细胞的细胞焦亡。Zhang等[21]发现天麻素通过lncRNA NEAT1/miR-22-3p信号通路来减弱脑缺血诱导的神经元细胞炎症。以上研究为在基因水平通过miRNA靶向药物治疗卒中后细胞焦亡提供了理论依据。当然,miRNA调节许多复杂的信号转导通路途径,可能其受体产生更全面的调节作用。因此,在临床应用前还需要进行严格的风险和安全性评估。但由于miRNA循环水平与疾病的发生有关,因此量化其分泌物中miRNA的表达可能成为卒中诊断和评价的生物学标志物。

3.3 细胞焦亡与卒中后抑郁 卒中后抑郁是卒中幸存者功能恢复中最常见的精神病并发症之一,会增加复发性卒中的风险和死亡率。据统计,卒中患者的PSD第一年的患病率高达33%,这种疾病的特征是导致认知缺陷、失眠、社交功能障碍。尽管PSD对患者的生活质量产生了严重影响,但它经常被忽视或未经治疗。Zhou等[34]使用半胱氨酰白三烯受体2(CysLT2R)拮抗剂HAMI3379(HM3379)在对沙鼠进行短暂性全脑缺血(tGCI)和空间约束应激诱导的PSD模型中发现HM3379可下调含有NLRP3炎性小体和NOD样受体pyrin结构域的蛋白表达,证明HM3379通过抑制NLRP3炎性小体依赖的细胞焦亡经典途径对PSD有益。总之,细胞焦亡是一种新型炎性细胞程序化死亡途径,参与了PSD的发病机制。

4 细胞焦亡与抑郁症

抑郁症是一种常见的精神障碍,它严重地制约着人们的社会心理功能,并影响着人们的生活质量。目前对抑郁症患者预后及管理仍旧有很大挑战。抑郁症的直接发病机制目前尚不清楚,近期一项临床研究表明,患有抑郁症的儿童单核细胞中IL-1/IL-6的过表达和甲羟戊酸激酶的下调可能会使细胞过早衰老、发炎直至形成细胞焦亡[35]。研究发现慢性乙醇暴露(CEE)诱导了肠道微生物群失调和肠道稳态破坏,菌群改变导致循环系统中的LPS和炎症因子增加,继而激活海马区NLRP3炎性小体,导致神经炎症和抑郁样行为。Li等[36]发现抑郁小鼠海马星形胶质细胞的焦亡。另外,近期研究表明NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡可能由miRNA-27a调节。相关miRNA通过细胞焦亡途径在抑郁症的发展中起关键作用。总之,随着细胞焦亡与抑郁症的相关研究不断深入,进一步明确细胞焦亡途径对抑郁症的研究具有一定意义。

4.1 NLRP3炎性小体介导细胞焦亡途径与抑郁症 近年来认为NLRP3炎性小体介导的神经炎症和小胶质细胞活化是抑郁症加重的重要原因。研究发现重度抑郁症与NLRP3小体诱导的神经炎症之间存在密切的相关性。在慢性不可预测的轻度应激(CUMS) 诱导的抑郁小鼠模型中发现血清和海马中IL-1 β蛋白的水平显著升高,但在NLRP3基因敲除小鼠中却没有。原因可能是基因敲除小鼠MAPK、NF-κB通路被抑制导致的。随着X射线的应用越来越广泛,放射性脑损伤的机会也随之增加。Xu等[37]研究表明,X射线诱导大鼠前额叶皮质ROS的生成,促进高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达,并通过NLRP3炎性小体信号通路的激活,使其释放促炎细胞因子、体内外的细胞焦亡发生,从而诱发神经元丢失及类似抑郁症的行为。进一步应用HMGB1抑制剂甘草甜素后发现因X射线引起的抑郁症样行为改变被逆转。类似的,Li等[38]在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中发现高血糖以NLRP3依赖性方式导致海马神经元细胞焦亡和凋亡。Yang等[39]在谷氨酸钠诱导的大鼠抑郁模型中,发现米诺环素和Caspase-1特异性抑制剂(VX-765)均可改善大鼠的抑郁样表现,但两者机制不同。米诺环素的使用显著降低了HMGB1/晚期糖基化终产物受体(RAGE)/NLRP3和GSDMD诱导的海马神经元凋亡。但VX-765仅抑制GSDMD信号传导,表明GSDMD依赖性焦亡在抑郁症进展中的关键作用。总之,细胞焦亡与抑郁症之间的相互作用机制的有很大研究空间。近期大多数研究以NLRP3依赖性焦亡为靶点来治疗抑郁症。重症抑郁症小胶质细胞的数量下降加剧了抑郁症发生,此时诱导小胶质细胞的激活可以显著改善抑郁症的症状。适当的炎性小体激活一定程度上可以改善患者预后,但过度激活和完全抑制都会导致抑郁症状的恶化[40]。因此,适当的调节NLRP3炎性小体依赖性焦亡途径,对于治疗抑郁症具有一定意义。

此外,ATP通过调控腺苷酸活化蛋白激酶(5-AMP activated protein kinase,AMPK)信号对巨噬细胞炎性小体的激活及细胞焦亡产生影响。Deng等[41]证明AMPK通过巨噬细胞中的激酶或磷酸酶调节NLRP3炎性小体介导的磷酸化。鹿茸肽可以通过提高p-AMPK和沉默信息调节因子1(Sirt1)来抑制NF-κB、GSDMD-N、NLRP3、Caspase-1、裂解IL-1β及IL-18的表达,从而减轻CUMS刺激引起的抑郁样行为,AMPK和Sirt1在鹿茸肽缓解抑郁症中发挥了关键作用[42]。因此,当抑郁症发作时,AMPK的磷酸化高表达可以抑制依赖NLRP3炎性小体的细胞焦亡,激活AMPK及其相关通路可能会成为抑郁症治疗的突破口。

4.2 miRNA介导细胞焦亡途径与抑郁症 Li等[43]研究发现miRNA-27a水平在抑郁症患者的血清和LPS及慢性社会挫败应激(CSDS)小鼠抑郁症模型血清及海马中表达下降,进一步给予异甘草素后发现通过miRNA-27a/SYK/NF-κB信号通路调控抑制NLRP3级联控制的细胞焦亡,从而减轻抑郁症状。Zhu等[44]研究发现木犀草素的抗乳腺癌相关抑郁症的作用是通过调节miR-124-3p/TNF-α/泛素连接酶6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)相关途径和抑制神经元细胞焦亡和炎症来实现的。由此可见,进一步探索miRNA介导的细胞焦亡途径所致的抑郁症研究具有重要意义。除此之外,Tian等[45]用利血平处理小鼠,发现小鼠海马中过度激活的小胶质细胞诱导Caspase-11依赖性细胞焦亡途径来诱导神经炎症,而芍药苷通过抑制此途径发挥抗抑郁作用。Yang等[46]发现匹诺霉素通过抑制海马体中P2X4受体介导的细胞焦亡来缓解CUMS诱导的大鼠模型的抑郁样行为。

5 总结与展望

细胞焦亡与卒中及抑郁症各种病理机制相互联系,在疾病发生、发展中扮演着重要的角色。诸多体内、体外实验研究表明,通过炎性小体等介导的细胞焦亡途径相关药物治疗,可以显著缓解卒中及抑郁症模型的发病症状。目前关于细胞焦亡在卒中及抑郁症疾病中的作用仍旧以基础研究为主,故减少细胞焦亡的发生及调节炎症因子释放相关因子在卒中及抑郁症的治疗具有很大的前景,未来仍需大量的基础及临床研究来探索细胞焦亡与卒中及抑郁症之间的关系。