人参皂苷Rg1对心肌纤维化模型小鼠TLR4/MyD88通路的影响*

陈昕, 杜琎, 高磊, 阚晨静, 黄项鸣, 徐兴闻, 朱军, 杨平印, 石开虎**

(1.溧阳市中医医院 介入科, 江苏 溧阳 213300; 2.南京中医药大学附属中西医结合医院 心胸外科, 江苏 南京 210038; 3.南京中医药大学中医学院 中西医结合学院, 江苏 南京 210038)

心肌纤维化是多种心脏疾病共同的病理过程,是心脏结构重构的重要环节之一。心肌细胞凋亡增加,心肌胶原蛋白分泌增多、胶原纤维不断沉积、心肌组织发生不同程度的纤维化,久之心脏顺应性降低、结构改变,从而引发心律不齐、心力衰竭等心脏疾病[1]。有研究指出,Toll样受体4/髓样分化因子88(toll like receptor 4/recombinant myeloid differentiation factor88,TLR4/MyD88)信号通路在延缓纤维化进程中有重要作用,其主要是通过调控心肌细胞凋亡达到干预心肌纤维化进程的目的[2]。中药“人参”在临床上参与很多心脏疾病的治疗,而人参皂苷Rg1(ginsenoside rg1, GRg1)作为其主要效用成分,有强心、抗休克、对抗心律失常、减轻心肌缺血缺氧再灌注损伤、促进心肌血管再生等重要作用,临床多用于治疗心肌梗死、动脉粥样硬化、心律失常等多种疾病[3]。申文宇等[4]研究指出,人参皂苷Rg1能够调控内源性线粒体凋亡途径,抑制细胞色素C(cytochrome C,Cyt-c)释放,降低凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinases 3,caspase 3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteinyl aspartate specific proteinases 9,caspase 9)表达水平,减少大鼠心肌细胞凋亡、调节心律、保护心肌。关于人参皂苷Rg1是否通过TLR4/MyD88通路干预心肌纤维化的研究较少,本研究旨在探索人参皂苷Rg1通过调控TLR4/MyD88通路干预心肌细胞凋亡、影响心肌纤维化的机制,以期对临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 选用成年雄性C57BL/6J 小鼠30 只,由江苏省中西医结合医院动物实验中心提供。所有动物实验符合实验动物学习指南,无菌喂养,饮用水和饲料均经过高温消毒,环境温度约在24 ℃,湿度42%～48%。本实验研究获得江苏省中西医结合医院伦理委员会批准[许可证号SYXK(苏)2021-0025)]。

1.1.2主要试剂 人参皂苷Rg1药物采购于南京草本源生物科技有限公司,TLR4(货号 14358S)、Bax(货号14796S)、MyD88(货号4283S)、胶原蛋白1(collagen-I, COL-1,货号 72026S)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA货号19245S)、β-actin(货号D191048)抗体购买于Cell Signaling公司,Bcl-2(货号ab32124)、GAPDH(货号 ab9485)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(货号 ab97051)购买于abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1建模与给药方案 取30只成年雄性C57BL/6J小鼠,随机分为对照组、模型组和人参皂苷Rg1组,对照组皮下注射0.9%氯化钠溶液,模型组皮下注射异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)5 mg/kg,治疗组皮下注射ISO 5 mg/kg、同时予以人参皂苷Rg1 20 mg/kg灌胃,1次/d,连续干预14 d。给药期间所有小鼠均正常饲养,自由饮水。

1.2.2观察心肌组织病理学改变 建模结束后,用1%的戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射,取血;后打开胸腔,游离心脏、离断主动脉,取出小鼠心脏用4%的福尔马林溶液浸泡,脱水、石蜡包埋、切0.4 μm薄片、烤片、脱蜡、烘干,分别马松染色(Masson)、苏木精-伊红染色法(HE)染液染色,电子显微镜下观察。

1.2.3免疫印迹试验(WB)检测凋亡相关通路蛋白的表达 取出冻存的心肌组织研磨,RIPA裂解液提取总蛋白,BCA检测蛋白总量,用分离胶和浓缩胶进行分离蛋白后,将蛋白转移到PVDF膜上,加入抗体TLR4(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、COL-1(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),山羊抗兔二抗(1∶2 000)室温孵育1 h,经ECL显影后,使用软件对PVDF膜蛋白条带进行扫描分析,计算灰度值,GAPDH为内参。

1.2.4聚合酶链式反应(PCR)检测TLR4、MyD88、兔抗人单克隆抗体(Bcl2-associated X, Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)表达 引物由生工生物在线引物设计(表1),采用trizol(Invitrogen)提取心肌组织总RNA于A260 nm/A 280 nm≥1.8鉴定RNA纯度。取2 μg总RNA为模板,参照TAKARA公司的试剂盒说明书进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。20 μL PCR反应体系,实时定量PCR扩增,以β-actin为内参照。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。

表1 PCR检测引物序列

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 心肌组织学改变

HE染色结果显示,对照组小鼠心肌细胞形态规则正常,细胞间排列顺序整齐;ISO组中纤维化后的小鼠心肌细胞形态不规则,体积明显增大,组织间水肿明显,细胞排列紊乱;人参皂苷Rg1组小鼠心肌细胞排列稍规则,细胞体积稍有增大,细胞排列恢复正常。见图1。Masson染色结果显示,对照组中,心肌细胞形态正常、排列整齐,而ISO组中心肌细胞排列杂乱、大量胶原纤维聚集;人参皂苷Rg1组小鼠心肌细胞形态接近正常、排列尚齐,偶可见少量蓝紫色聚集的胶原纤维聚集。见图2。

对照组 ISO组 人参皂苷Rg1组

对照组 ISO组 人参皂苷Rg1组

2.2 凋亡相关通路蛋白的表达

WB结果表明,与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织中α-SMA、COL-1纤维化蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),提示造模成功;与ISO组比较,Rg1组小鼠心肌组织中COL-1、α-SMA的表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示Rg1对心肌纤维化有干预作用。见图3。与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织中TLR4、MyD88、Bax蛋白表达明显升高,Bcl-2表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与ISO组比较,Rg1组小鼠心肌组织中TLR4、MyD88、Bax的表达明显降低,Bcl-2表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图3 各组COL1及α-SMA小鼠心肌纤维化相关蛋白表达

图4 各组小鼠心肌组织中TLR4TLR4、MyD88、Bax及Bcl-2蛋白表达

2.3 TLR4、MyD88、Bcl-2、Bax的基因表达

PCR结果表明,与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织中TLR4、MyD88、Bax的mRNA明显升高,Bcl-2mRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与ISO组比较,Rg1组小鼠心肌组织中TLR4、MyD88、Bax的mRNA明显降低,Bcl-2mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 各组小鼠心肌组织中 TLR4、MyD88、Bcl-2及Bax的基因表达

3 讨论

心肌纤维化是多种心脏疾病发生心脏结构重构的关键病理基础,其发病机制复杂,目前认为心肌细胞外基质不断沉积在心肌纤维化中起重要作用[5]。而心肌组织中胶原纤维不断沉积,胶原比率失调、细胞排列紊乱是心肌纤维化的标志,其中含量最多的是COL-1[6],在心脏瘢痕组织中高表达。当胶原沉积增多,各型胶原比率失调和排列紊乱使心肌发生纤维化,并且纤维化发生会诱导更多的炎症因子释放,会进一步加重纤维化的过程[7-8]。大量基础研究发现,TLR4/MyD88通路作为经典的信号通路能够通过细胞凋亡、程序性坏死、焦亡等多种途径,减轻心肌细胞的氧化应激反应、控制心肌细胞炎症、减少细胞凋亡等途径调控心肌纤维化发展[9-11]。因此通过有效手段干预心肌纤维化进程有望能够用于临床心脏疾病的治疗。本实验用COL-1以及α-SMA作为心肌纤维化的检测指标,本次实验研究发现,皮下注射异丙肾上腺素组的小鼠心肌组织中COL-1、α-SMA蛋白表达增加,说明心肌纤维化模型建立的成功,而通过人参皂苷Rg1干预后COL-1、α-SMA蛋白表达恢复到正常组水平,说明人参皂苷Rg1能够减轻ISO诱导的心肌纤维化损伤。本实验造模方法选用皮下注射ISO(5 mg/kg)建立小鼠心肌纤维化模型[5],HE染色结果显示心肌细胞体积增大,排列紊乱,形态不规则,细胞间质不均匀增多,Masson染色模型组心肌纤维排列紊乱,结构破坏,组织增生严重,并伴有细胞坏死,瘢痕出现,均提示皮下注射异丙肾上腺素能够建立心肌纤维化模型,人参皂苷Rg1干预后细胞体积变小,排列恢复一定次序均说明人参皂苷Rg1对ISO诱导的小鼠心肌纤维化有明显的改善作用,能够干预心肌纤维化进程。

Toll样受体中的经典受体TLR4是一种膜蛋白受体,其主要是通过识别细菌脂多糖,结合可溶性穿梭蛋白LBP和LPS,继而激活下游MyD88及NF-kB信号通路,激活机体免疫应答,炎症因子IL-β、IL-8、TNF-α大量释放,引起心肌损伤[12-15]。细胞凋亡存在于多种有心肌纤维化的心脏疾病中,有人认为多种病毒可以触发细胞凋亡从而加快了心肌纤维化进程, 细胞凋亡可能是引起病毒性心肌炎向心肌病转变的第3种机制[16]。我国古典医籍《本草经》中谈到人参具有“主五脏、安精神、定魂魄、止惊悸”的作用[17]。人参皂苷Rg1作为中药人参的主要成分,有增强心肌收缩力,稳定心率,改善心肌代谢等功能。彭程飞等[18]通过动物实验发现,人参皂苷Rg1能够有效抑制大鼠急性心肌梗塞后的心肌纤维化发生。细胞凋亡途径有两种途径,分为线粒体途径和死亡受体途径,细胞外途径主要是死亡受体分子活化后,caspase酶原募集,凋亡酶体激活,pro-caspase8水解活化后,caspase8活化,激活下游caspase3,引起目标细胞发生凋亡;线粒体途径是激活bcl-2、Bax、Bak等促凋亡细胞,引起细胞凋亡的发生[19-23]。Luo等[24]通过实验研究发现,人参皂苷Rg1能够干预TLR4通路,缓解LPS诱导的心肌损伤,恢复心肌部分功能。此外,研究发现,平滑肌肌动蛋白α-SMA在大部分平滑肌肌型细胞的肌成纤维细胞中表达较高,而心肌纤维化的主要标志之一[25]。本实验在ISO组以及人参皂苷Rg1组中检测了TLR4、MyD88的表达,与对照组比较ISO组中TLR4、MyD88的表达无论在RNA水平还是蛋白水平都明显升高,而人参皂苷Rg1组较ISO组呈现出明显下降,说明Rg1灌胃在ISO诱导的心肌纤维化模型中能降低TLR4、MyD88的表达。同时检测凋亡相关指标,发现ISO组较对照组小鼠心肌组织中Bax的表达明显升高,Bcl-2的表达则明显降低;而人参皂苷Rg1组与ISO组比较,Bax表达明显降低,Bcl-2的表达则升高明显,也证实了人参皂苷Rg1能明显改善心肌纤维化组织中的细胞凋亡水平。

综上所述,人参皂苷Rg1可能通过抑制TLR4/MyD88信号通路活化,改善小鼠心肌组织中细胞凋亡水平,从而延缓心肌纤维化进程,发挥心脏保护作用。