星状神经节阻滞对中枢性疼痛大鼠脊髓中IL-1β、IL-6及TNF-α的影响*

邵金奇, 姚旌

(贵州医科大学附属医院 疼痛科, 贵州 贵阳 550004)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)多见于交通事故、跌倒、违规或运动损伤,近年来脊髓损伤的发生率呈逐年升高趋势[1],中枢性疼痛是脊髓损伤的顽固性并发症之一,严重影响患者伤后的运动康复及感觉功能的恢复。由于脊髓损伤后造成的中枢性疼痛机制至今尚未完全清楚[2],因此缺乏有效的治疗措施,主要以心理治疗、手术治疗、药物治疗等综合治疗为主,但是效果往往不理想[3]。本课题组在前期研究中发现星状神经节阻滞对外周组织中促炎症因子的释放具有调节作用[4-5],亦有研究报道中枢神经系统的促炎症因子在中枢性疼痛的发生发展中起到重要作用[6]。本研究通过观察星状神经节阻滞对中枢性疼痛模型大鼠疼痛行为的影响,同时检测模型大鼠脊髓组织中白细胞介素-1β(interleu-kin-1β,IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

C2500-R-230V微型高速离心机(美国Labnet公司生产),ICV-450电热恒温培养箱(日本ASONE生产),Multiskan MK3全自动酶标仪(Thermo scientific生产),YLS-6B智能热板仪(北京众实科技有限公司)。大鼠白细胞介素-6(interleukin,IL-6)、IL-1β、TNF-α、酶联免疫吸附测定试剂盒(Elabscience生产)。

1.2 研究方法

1.2.1动物与分组 选取112只SPF级成年SD雄性大鼠,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,体质量200～250 g,许可证号SCXK(辽)2015-0001、SCXK(辽)2020-0001,在(23±1)℃、湿度(50±10)%的房间内,接受12 h/12 h的明暗环境适应性喂养2周,自由饮水和安全饮食,所有操作均符合动物伦理要求及实验动物使用原则。大鼠适应性喂养两周后,随机分成空白组(不做任何处理)、假手术组(手术,但不损伤硬脊膜)、模型组(手术钳夹法脊髓损伤造模)及治疗组(手术造模后行星状神经阻滞),每组28只。模型组、假手术组、治疗组于造模成功后每天3次膀胱挤压排尿直至排尿反射恢复5～7 d。各组动物如有死亡及时补充,保证每组28只。

1.2.2中枢性疼痛模型的制备 采用SCI手术制备大鼠中枢性疼痛模型[7-8]:模型组大鼠用4 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔内注射麻醉后,确定 T10部位,俯卧位固定,以T10为中心行后正中纵切口2～3 cm,手术将T9～T11椎板及棘突摘除并显露硬膜两侧缘,同时注意保证硬脊膜完整性;手术区域止血后,用止血夹(标定力为100 g)完全钳夹脊髓1 min,松开止血夹,可见钳夹处硬脊膜出现鲜红血肿,止血、消毒伤口、缝合伤口;术后使用烤灯取暖,至实验大鼠自然苏醒。脊髓损伤造模成功的标志:钳夹部位脊髓损伤节段处硬脊膜充血水肿,尾巴出现痉挛性摆动,双下肢及躯干出现迟缓性痉挛或抽搐摆动。假手术组仅咬除T9～T11椎板,显露硬脊膜后,止血、消毒、缝合伤口。通过热痛敏潜伏期缩短判断大鼠脊髓损伤造模成功,通过脊髓损伤模型大鼠疼痛程度的加重判断中枢性疼痛的造模成功。

1.2.3星状神经节阻滞方法 治疗组,大鼠脊髓损伤术后行全颈部备皮,碘伏消毒颈部正中切口,分离气管右侧结缔组织,于右侧颈总动脉分叉处背侧面找到梭型的颈上神经节, 在其斜向外下方约3 mm处见一个淡黄色团块,即为颈交感神经干(右星状神经节),将其近心端离断,最后消毒、缝合伤口。造模成功的标志:大鼠清醒后出现典型的霍纳综合征,如右侧眼睑持续下垂、瞳孔缩小、眼裂变窄等[9-12]。

1.3 行为学观察及运动功能学评价

1.3.1行为学观察 术后第6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d及14 d时观察大鼠对其后肢和身体尾部皮肤修饰、搔抓、舔咬及自发嘶叫等过度自残行为,同时测定大鼠热痛敏潜伏期(paw withdrawal latencies,PWL)。

1.3.2运动功能学评价 参照脊髓损伤评分标准(basso beattie bresnahan,BBB)运动功能评分进行双盲测量评分[13]。BBB评分分为3个部分:第一部分为0～7分,评判双下肢各个关节的活动;第二部分为8～13分,评判双下肢步态的协调能力;第三部分为14～21分,评判运动中爪的精细动作能力[14]。将各组大鼠放置于100 cm×100 cm的开放区域内,观察大鼠双下肢肢体活动及评分。脊髓损伤后,模型组和治疗组大鼠苏醒后双下肢呈迟缓性瘫痪、BBB评分<2分,说明造模成功,采用BBB评分对大鼠脊髓损伤后14 d内的后肢运动功能进行评估,正常为21分、后肢瘫痪为0分。

1.3.3PWL测定 PWL采用智能热板仪进行测量,在室温条件下,将热板温度设定在(50±0.2)℃,然后所有大鼠均于造模成功后第5、7 及14 d时分别置于底部3 mm厚热板的透明玻璃罩中,并将大鼠双前肢用细线固定使其脱离热板表面,待其双后肢足底贴附于热板上时助手快速按下计时器按钮,记录大鼠从开始到出现缩足反应的时间,每只大鼠测量3次,每次间隔时间为5 min,取其平均值即为PWL;为防止烫伤,单次测定时间≤30 s。

1.3.4标本采集 造模后于6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d、14 d时,每组大鼠各4只麻醉成功后迅速取出T10损伤节段脊髓约6 mm,均分为2段,一段用于HE染色、另一段制备脊髓匀浆用于IL-1β、IL-6、TNF-α检测。

1.3.5IL-1β、IL-6、TNF-α检测 组织放入匀浆器中,以0.1 g∶0.9 mL冰生理盐水制备脊髓组织匀浆液,以3 000 r/min离心10 min,取上清液分为3管,采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平,按试剂盒说明书操作,在450 nm波长测量吸光度(A),再根据标准曲线求出各标本中IL-1β、IL-6、TNF-α的实际浓度。

1.3.6HE染色 将脊髓标本固定于4 %多聚甲醛中12 h后,脱水、包埋、切片等处理,切片厚度约3 cm、HE染色,并于光学显微镜(×200)下观察。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 行为学和运动功能学评分

术后6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d、14 d时,假手术组大鼠后肢运动功能完全恢复;与假手术组比较,模型组大鼠后肢运动功能均受损,但随着时间的延长后肢运动功能逐渐改善,差异有统计学意义(P<0.000 1);与模型组比较,治疗组大鼠在各时点后肢运动功能改善均优于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠术后各时点BBB评分

2.2 PWL

术后5 d、7 d、14 d时,空白组与假手术组大鼠PWL比较,差异无统计学意义(P>0.05);而模型组与治疗组大鼠PWL均降低,差异有统计学意义(P<0.05);与假手术组比较,模型组大鼠PWL降低,差异有统计学意义(P<0.000 1);与模型组比较,治疗组大鼠PWL增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：(1)与假手术组比较, P<0.01;(2)与模型组比较, P<0.05。

2.3 IL-1β、IL-6、TNF-α含量

术后6 h、12 h、24 h、48 h、5 d、7 d、14 d时,假手术组大鼠脊髓组织匀浆中各炎症因子水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);与假手术组同时点比较,模型组大鼠在7个时点IL-1β、IL-6及TNF-α含量均出现不同程度的升高,差异有统计学意义(P<0.001或P<0.000 1);与模型组同时点比较,治疗组大鼠在7个时点IL-1β、IL-6及TNF-α含量均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为组织匀浆中IL-1β水平,B为组织匀浆中IL-6水平,C为组织匀浆中TNF-α水平;(1)与假手术组比较, P<0.01;(2)与模型组比较, P<0.05。

2.4 组织学改变

空白组和假手术组脊髓组织未见出血坏死及组织水肿现象。术后24 h时,模型组和治疗组大鼠脊髓灰白质分界不清,灰质区域见片状出血、组织水肿及细胞核固缩,但治疗组较模型组稍轻微;术后第14天时,模型组和治疗组大鼠受损部位脊髓组织的白质区域见明显的坏死后形成的囊腔,但治疗组较模型组囊腔稍小。见图3。

注：A为空白组,B为假手术组,C为模型组术后24 h,D为模型组术后14 d,E为治疗组术后24 h,F为治疗组术后14 d。

3 讨论

近年来,炎症因子反应机制是中枢性疼痛的重要发病机制之一[15],过度的炎症反应因子的释放会加重中枢性疼痛的发生。已有研究表明,在急性脊髓损伤的早期,会释放大量IL-1β、IL-6和TNF-α等多种炎性细胞因子[16-17],促使大部分的胶质细胞呈促炎M1型转化,并聚集于脊髓损伤部位,分泌更多的炎性细胞因子,形成级联瀑布效应,进一步加重局部炎症反应,破坏残存的神经元,形成脊髓空洞和胶质瘢痕,从而加重中枢性疼痛的发生。此外大量的研究结果显示中枢神经系统中的炎症反应机制和免疫机制共同参与神经病理性疼痛的发生发展,当神经系统受到损伤时,机体的免疫细胞和炎症细胞就会激活并产生和释放多种炎症因子,进一步使外周感受器的敏感性增加及伤害感受器的敏化,从而出现异常性疼痛及痛觉过敏[18]。研究表明,当敲除小鼠体内IL-1β后,其疼痛敏感性降低,但是对敲除IL-1β的小鼠神经损伤处注射外源性IL-1β时,则引起显著的痛觉过敏[19]。Garraway等[20]通过建立脊髓损伤大鼠模型中发现脊髓损伤后TNF-α表达会增加,进而导致疼痛行为的发生。亦有学者发现在发生中枢性疼痛24 h内IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子会大量产生并加重神经病理性疼痛的发展[21-22]。此外,Fiore等[23]报道,在神经病理性疼痛模型中,干扰促炎性细胞因子或使用IL-1β、IL-6和TNF-α的阻滞剂均显示出减轻痛觉过敏的作用。因此本次研究在造模成功后,即刻予以星状神经节阻滞治疗,从而减轻炎症反应的发生发展,达到治疗脊髓损伤后中枢性疼痛的目的。在此次实验中,本研究发现治疗组及模型组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α较假手术组明显升高,同时其PWL也较假手术组大鼠降低,说明脊髓损伤后IL-1β、IL-6和TNF-α的含量会增加,同时伴随着痛觉过敏的发生。星状神经节又被称作颈胸交感神经节,是由C6-C7发出的颈下交感节以及T1交感神经节融合形成的。星状神经节阻滞(stellate ganglion block,SGB)属于一种临床治疗方法,将局部麻醉药物注射在颈部交感神经或附近组织,局麻药液弥散至支配头面部、颈部、上肢及胸部的交感神经纤维即可进行有效的阻断[24],能够对机体内分泌系统、自主神经系统、免疫系统等积极的调节,确保动态平衡状态。Liu等[25]通过临床试验研究发现,早期对严重创伤病人进行SGB后,观察到血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量较对照组显著降低,提示SGB可通过抑制IL-6、IL-1β和TNF-α的表达从而参与调节早期炎症反应。此外也有学者研究显示,对带状疱疹后遗神经痛的患者予SGB治疗后,其疼痛强度及持续时间均得到有效改善[24],故认为是由于SGB抑制了交感神经活性,从而增加了组织血流量,减轻炎症反应,进一步降低了中枢敏化的发生。同时本课题组在前期研究中[4-5],也发现SGB能调节自主神经系统的稳态,有效改善外周炎症反应,扩张外周血管,带走体内炎症介质或致痛物质,有效改善周围性神经病理性疼痛的作用,因此被用于各类疼痛的治疗,并且疗效甚佳,如带状疱疹后遗神经痛、缺血性脑疾病、复杂区域疼痛综合征、颈肩部疼痛等[26-27];但对于治疗中枢性疼痛方面的研究报道目前较少,本研究通过构建中枢性疼痛模型研究SGB对中枢性疼痛的治疗效果,并通过实验证明了脊髓损伤后IL-1β、IL-6和TNF-α含量增加以及PWL缩短。与模型组比较,经过SGB治疗后IL-1β、IL-6和TNF-α含量有所降低以及PWL有所改善,从而证明了SGB可降低受损脊髓组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,并推测降低IL-1β、IL-6和TNF-α含量后可减轻疼痛过敏的发生。本实验通过脊髓损伤获得中枢性疼痛模型,但由于脊髓损伤后早期大鼠后肢运动功能恢复欠佳,从而影响PWL测定结果,因此本研究于造模成功5 d后进行相关测定。本研究结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠出现不同程度的后肢和身体尾部皮肤修饰、搔抓、舔咬等自噬行为,且PWL缩短及BBB评分降低。但对中枢性疼痛大鼠进行SGB治疗后,随着时间的延长,PWL及BBB评分有所改善,根据该结果推测可能是SGB后IL-1β、IL-6和TNF-α的表达减少,从而降低了大鼠对伤害感受器的敏感性,减少了痛觉过敏的发生,因此加快了运动功能的恢复。与模型组比较,治疗组大鼠脊髓组织学结构有所改善,提示了SGB治疗后也能在一定程度上加速脊髓组织学结构的恢复,也能缓解中枢性疼痛的严重程度;此外通过分析模型组或治疗组大鼠各个组间IL-1β、IL-6和TNF-α的变化趋势,可以看出3种炎症因子在造模后24 h左右存在一个高峰期,并随着时间的延长,其含量会随之降低,该结果也提示了对中枢性疼痛的治疗时机尽量在炎症因子高峰期前,尽早对脊髓损伤进行干预治疗。

综上所述,SGB可减轻中枢性疼痛模型大鼠的脊髓损伤及改善脊髓功能,其机制可能与降低脊髓损伤局部组织中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量有关。此次研究结果提示,SGB可作为脊髓损伤后中枢性疼痛大鼠的一个治疗措施,但其治疗作用与脊髓损伤后产生中枢性疼痛的具体转导通路及作用机制仍有待进一步研究。