不同吸附剂产品对黄曲霉毒素B1及赤霉烯酮吸附效果评价

■ 段海涛 卢丽枝 梁蒙蒙 王文雅 黄安群 霍文颖 李 俊 张 磊

（1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450046；2.广西壮族自治区畜牧站，广西南宁 530022；3.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；4.河南省兽药饲料监察所，河南郑州 450008）

真菌毒素是由真菌产生的有毒次生代谢产物[1]。目前已知的真菌毒素有300 多种[2]。据联合国粮食及农业组织（FAO）估算，全世界每年约有25%的谷物受真菌毒素污染，约2%的农产品因霉变而失去营养和经济价值，给农业造成严重的经济损失[3]。其中玉米赤霉烯酮（ZEN）、黄曲霉毒素（AFT）在饲料中危害较大[4]。由镰刀菌产生的玉米赤霉烯酮在霉变粮食中最为常见。已有研究证实，ZEN 在动物体内产生的生物学反应与雌二醇类似，影响子宫内膜细胞生长、卵母细胞成熟及卵泡颗粒细胞的增殖[5]。AFT 是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，其主体结构为二呋喃环和香豆素[6-8]。目前鉴定出的AFT 有20 多种，主要分为B 族、G 族和M 族等，毒性最强的是AFB1[9-10]。AFB1 是一种广泛存在于食品和畜禽饲料中的污染物[11-13]。黄俊恒等[14]2018 年从19 个省市收集442 份饲料及饲料原料，检测到饼粕类样品受黄曲霉毒素B1（AFB1）污染严重。王国强等[15]对来自不同省份的321份饲料及饲料原料样品进行了毒素检测，发现高达91.36%的饲料及饲料原料受到两种及以上真菌污染[16]。霉菌毒素污染正成为畜禽健康最为严重的挑战之一[17]。被真菌毒素污染的饲料可抑制蛋白质和酶的合成，破坏组织细胞结构，损坏动物的肝肾、肠道、神经等器官和组织[18-20]。还可能会导致饲料的营养价值和适口性降低，饲料转化率下降，从而使动物拒绝进食，生长较慢，免疫功能受到抑制，容易生病，甚至死亡[21]。吸附剂与霉菌毒素分子结合的效率是影响脱毒效果最重要的因素之一。通常动物摄入霉菌毒素污染的饲料后，随着咀嚼、消化作用，毒素分子会快速分散于胃液中，胃壁及小肠对霉菌毒素分子的吸收是迅速的，而吸附剂快速地与毒素分子结合，能够竞争性地减少毒素由消化道进入体循环的量，从而缓解毒性作用[22]。霉菌毒素吸附剂种类主要包括无机吸附剂（如活性炭和硅酸盐类矿物质）及有机吸附剂（如酵母细胞壁提取物、植物纤维和细菌等）。硅酸盐类矿物质，如蒙脱石、沸石等具有含量丰富、分布广泛等优点，可以大规模应用在畜牧养殖业中[23]。

由于饲料中霉菌毒素污染情况复杂，不同的霉菌毒素化学结构和生物学特性完全不一样，造成霉菌毒素吸附剂对饲料中毒素的吸附能力差异很大[24]。不同吸附剂产品的脱毒效果不同，类型、浓度等均是影响其吸附效果的因素。目前，吸附剂产品研究主要集中于新产品研发，其吸附效果评价主要采用体外吸附评价方法，缺乏体外模拟胃肠道消化环境状态的吸附效果评价。因此，本试验通过体外模拟胃肠道环境，对真菌毒素吸附剂的吸附效果进行评估，探究不同吸附剂类型对膨化玉米中AFB1 及ZEN的吸附效果，为饲料及原料企业评估吸附剂效果提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

试验所用6 种霉菌毒素吸附剂产品均为市场购买，分别编号为硅铝酸盐①（过325 目筛，表观黏度11 mPa·s，水和硅铝酸盐含水量<9%，硅酸铝盐含量>60%），蒙脱石②（含量>98%，过600 目筛，表观黏度40 mPa·s），酵母细胞壁③（啤酒酵母细胞壁），硅铝酸盐④（钠基，过200 目筛，表观黏度20 mPa·s），硅铝酸盐⑤（钙基，过200 目筛，表观黏度25 mPa·s），蒙脱石⑥（含量>60%，过400目筛，表观黏度20 mPa·s）。

1.1.2 标准品及试剂

AFB1 标准品（美国斯坦福分析化学公司），ZEN标准品（美国斯坦福分析化学公司）。

乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），乙腈水溶液（90+10），试验用水均为超纯水。

1.1.3 仪器

高效液相色谱仪（配备荧光检测器，安捷伦1260），超声波清洗仪（上海冠特超声仪器有限公司），氮吹仪（TTL-DCII 型，北京金洋万达科技有限公司），玉米赤霉烯酮免疫亲和柱（北京中检维康生物技术有限公司）。色谱柱（agela odyssil, C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；柱温：25 ℃）

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

AFB1 提取溶液：将84 mL 乙腈加入到16 mL 水中，混匀。

AFB1衍生溶液：量取20 mL三氟乙酸、70 mL水，混匀后加入10 mL冰乙酸，混匀。临用现配。

AFB1 标准储备溶液（1 000 μg/mL）：用乙腈完全溶解标准品，配制成AFB1含量为1 000 μg/mL的标准储备溶液，-20 ℃保存，有效期为6个月。

AFB1 标准工作溶液：将1 000 μg/mL 的AFB1 标准储备溶液用乙腈稀释100 倍，得到浓度为10 μg/mL的稀释液，再将稀释液用乙腈稀释100 倍，得到浓度为100 ng/mL的AFB1标准工作溶液。

AFB1 标准系列溶液：将100 ng/mL 的AFB1 标准工作溶液用乙腈稀释1、5、10、20、50、100 倍，得到100、50、20、10、5、2、1 ng/mL 的标准系列溶液。临用现配。

乙腈水溶液（90+10）：量取90 mL 乙腈，加入到10 mL水中，混匀。

ZEN 标准储备溶液：用乙腈将ZEN 标准品溶解，制得稀释浓度为100 μg/mL 的标准储备液，-18 ℃下避光保存。

ZEN 系列标准工作溶液：将标准储备液用流动相稀释200、500、1 000、2 000、10 000 倍，配制成浓度为500、200、100、50、10 ng/mL的系列标准工作液，4 ℃避光保存。

人工胃液：以pH 7.00 PBS 为基础，再用37%的盐酸将pH 分别调至2.00，按0.89 U/mL 的比例添加胃蛋白酶，充分溶解后用0.22 μm微孔滤膜除菌，备用。

人工肠液：取6.8 g 磷酸氢二钠加入500 mL 水溶解[25]，用0.1 mol/L的氢氧化钠调节pH至6.8，另取10 g胰蛋白酶加适量水溶解，混合，用水定容至1 000 mL。

1.2.2 色谱条件选择

荧光检测器检测波长：AFB1、ZEN 激发波长274 nm，发射波长440 nm。

用甲醇和水按7：3 的比例作为流动相洗脱真菌毒素，柱温为40 ℃，AFB1 使用甲醇：水为55：45，ZEN 使用甲醇：水为70：30。进样量：AFB1 20 μL，ZEN 1 μL；流速：1.0 mL/min。

1.2.3 模拟胃肠道消化

分别称量5 g饲料样品用于AFB1吸附率试验，取4 g 样品用于ZEN 吸附试验，外源加入100 μL AFB1或ZEN 标准品，吸附剂添加量均为4 mg，于50 mL 离心管中，向其中加入人工胃液18 mL 调节pH 到2 左右，置于（39±0.5）℃恒温振荡器中220 r/min孵育1 h，取1 mL 上清液，13 000 r/min 离心5 min，取上清液测定真菌毒素含量，并计算吸附率。

分别向人工胃液消化后剩余的样品沉淀中加入18 mL 人工小肠液，置于（39±0.5）℃恒温振荡器中220 r/min 孵育1 h，取1 mL 上清液13 000 r/min 离心5 min，取上清液测定真菌毒素含量，并计算吸附率。

同时，分别向不盛有任何吸附剂的空白离心管中加入人工胃液消化液和人工小肠液消化液18 mL，设置空白组。

1.3 数据处理

每个试验点重复4 次，数据以“平均值±标准差”形式表示。采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，Dun‐can’s 法多重比较检验组间差异显著性，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 真菌毒素标准曲线

以真菌毒素标准品溶液的浓度为横坐标（X）、色谱峰面积为纵坐标（Y）绘制AFB1 及ZEN 的标准曲线。相关系数R2>0.99（见表1）。

表1 两种真菌毒素的标准曲线方程及相关系数

2.2 模拟胃肠道环境下吸附剂产品对真菌毒素的吸附效果

由表2 可知，吸附剂产品硅铝酸盐⑤对AFB1 的吸附效果显著高于硅铝酸盐①、蒙脱石②及酵母细胞壁③（P<0.05），与硅铝酸盐④及蒙脱石⑥吸附效果差异不显著（P>0.05）；吸附剂产品硅铝酸盐⑤对ZEN 的吸附效果显著高于硅铝酸盐①、蒙脱石②及酵母细胞壁③（P<0.05），与硅铝酸盐④及蒙脱石⑥吸附效果差异不显著（P>0.05）。

表2 体外吸附条件下的吸附率（%）

2.3 模拟胃肠道环境下吸附剂产品对真菌毒素的吸附效果

2.3.1 吸附剂产品对AFB1的吸附率效果

从表3可知，6种不同的吸附剂在模拟胃肠情况下对AFB1的吸附效果，各样品间差异不显著（P>0.05）。

表3 模拟胃肠道环境下吸附剂产品对AFB1的吸附率（%）

2.3.2 吸附剂产品对ZEN的吸附效果

由表4 可知，胃液条件下，吸附剂产品蒙脱石②及蒙脱石⑥对ZEN 的吸附效果显著高于吸附剂产品硅铝酸盐①、酵母细胞壁③、硅铝酸盐④及硅铝酸盐⑤（P<0.05），吸附剂产品硅铝酸盐④及硅铝酸盐⑤对ZEN的吸附效果差异不显著（P>0.05）。肠液条件下，吸附剂产品硅铝酸盐①及蒙脱石⑥对ZEN 的吸附效果显著高于样品蒙脱石②、酵母细胞壁③及硅铝酸盐④及硅铝酸盐⑤（P<0.05）。吸附剂产品③及④对ZEN 的吸附效果不显著（P>0.05）。

表4 模拟胃肠道环境下吸附剂产品对ZEN的吸附率（%）

3 讨论

3.1 胃液对吸附剂吸附率的影响

天然毒素是由真菌、植物或微生物代谢产生的，霉菌毒素是真菌的天然次生代谢物[26]，在饲料和食物链中普遍存在[27]。饲料中霉菌毒素污染严重影响动物的健康、生产性能及企业经济效益。为减轻霉菌毒素负面影响，向饲料中加入吸附剂，与毒素相互作用，帮助毒素通过胃肠道并降低其生物利用度。吸附效果因吸附剂类型而异。

AFB1 是一种极性霉菌毒素，含有β-羰基，β-羰基参与吸附过程[28]。ZEN 具有弱极性。早在1978 年就有研究证实，硅铝酸盐类矿物质在体外条件下能够很好地吸附AFB1[29]。在日粮中添加酵母细胞壁吸附剂可能对降低AFB1 的生理生物利用度产生积极影响[30]。钱潘攀等[31]研究了一种双效型细胞壁提取物，具有吸附毒素的能力。Yiannikouris 等[32]比较在存在基于酵母细胞壁的吸附剂和存在基于黏土的黏合剂水合硅铝酸钙钠的情况下放射性标记的AFB1在大鼠中的吸收药代动力学，结果表明酵母细胞壁具有降低AFB1体内吸收和防止AFB1污染的破坏作用的潜力。Kong 等[33]确定吸附剂产品通过体外模拟猪胃肠道pH条件的方法结合或降解AFB1 的功效，得出酵母细胞壁产品对AFB1 的吸附百分比为92.7%。Kolawole等[34]取得类似结果。Hajar 等[35]评估酵母菌株在胃肠道模拟条件下减少AFB1 的能力，结果表明酵母对AFB1的减少有显著影响。真菌毒素和酵母细胞壁之间的相互作用力与弱氢键和范德华键的疏水和静电相互作用[36]。Wang 等[37]认为蒙脱石可通过离子-偶极相互作用以及有疏水相互作用吸附AFB1。徐瑞等[38]研究表明，吸附型黏土对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的吸附率均较高,止泻型黏土、黏结型黏土对黄曲霉毒素的吸附率较高，对玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的吸附率较低。刘少文等[39]进一步证实，蒙脱石对AFB1 有较好的吸附效率，体外试验表明吸附率可达99%，但对玉米赤霉烯酮等吸附效果不理想。本试验研究发现，体外模拟胃液环境中，不同吸附剂产品类型对AFB1 及ZEN 的吸附效率均提升10%以上，在低pH 情况下离子吸附作用效果提升。本试验与前人结果[40]一致。Yiannikouris 等[32]使用带荧光检测的液相色谱法（LC-FLD）量化酵母细胞壁吸附剂和水合硅铝酸钙钠在两个pH下对AFB1的吸附能力，结果表明酵母细胞壁吸附剂和水合硅铝酸钙钠的吸附能力在低pH 下得到提升。Jutamas 等[41]和Kihal 等[42]取得类似结果。

3.2 肠液对吸附剂吸附率的影响

体外模拟肠液环境中，吸附剂产品对ZEN的吸附效果与在胃液中吸附效果差异较大。主要是因为酸性环境下ZEN仅以疏水力结合在吸附剂的表面，中性或碱性环境下，ZEN 阴离子增加了与边缘羟基以静电作用结合的吸附位点。王金全等[43]采用pH 3.0 的柠檬酸盐缓冲溶液和pH 6.5 的磷酸盐缓冲溶液分别模拟动物胃和肠道的pH 环境，固定温度和反应时长，选取12 种市售霉菌毒素吸附剂，评价其对ZEN 的体外吸附效果，结果表明，不同吸附剂在不同pH 反应介质中对ZEN 的吸附效果不同，其中绝大部分吸附剂在pH 6.5 条件下的吸附效率高于pH 3.0 时。杨新岗[44]通过体外模拟肠道环境，对4 种吸附剂吸附AFB1、ZEN 的吸附效果进行评定，结果表明：肠液对AFB1的吸附作用比在胃液中大，两者有显著差异，肠液条件下的吸附剂产品对ZEN 的吸附效果优于胃液条件。这与本试验结果一致。

4 结论

不同种类的吸附剂对真菌毒素的吸收作用差别较大。探讨吸附剂产品的吸附率时应考虑消化液的影响，本试验中，样品中硅铝酸盐类吸附剂吸附效果优于酵母细胞提取物。