黄藤素的生物学功能及其生产应用

■ 赵宜丰 甘利平 赵红月 赵晨凯 曹 乐 陈姿伊 王 朋 王金荣

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001）

黄藤素（palmatine，PAL），又名巴马汀，广泛存在于罂粟科、小檗科、半夏科和毛茛科不同代表植物的提取物中[1-3]。黄藤素的药用记录最早记载于《本草纲目》，在我国传统医学中，它被广泛用于治疗黄疸、高血压、炎症、痢疾等疾病[4-6]。2010 年被收录于《中国兽药典》。近年来，越来越多的研究聚焦于黄藤素抗炎、抗氧化等生物活性的探究，并初步阐明抗炎、抗氧化的作用机制。目前黄藤素在动物上的研究尚浅，在一定程度上限制了黄藤素在动物生产中的应用。文章对黄藤素的结构特征、吸收代谢、作用机制进行介绍，并总结了其在生产上应用的最新研究进展。

1 黄藤素的结构及理化性质

黄藤素存在于多种植物中，包括黄柏、黄连[7]、延胡索[8]、心叶黄芩和矢状黄芩等，呈黄色、无臭、味极苦的针状结晶。其分子式为C21H22NO4，相对分子质量为352.4 u，微溶于水，溶解度随温度的增加而增加。黄藤素的化学结构具有四元原小檗碱共有的四环骨架，由5,6-二氢二苯并喹啉组成，C-2，3 和C-9，10 处有四个甲氧基（图1A）。在生理pH 下，黄藤素以亚胺阳离子的形式存在，其特征是极性C＝N+键容易与周围负电子基团发生亲核加成反应，在强碱性环境中C＝N+键断裂在C8 位置引入羟基，转化为游离碱，即8-羟基加合物（图1B）。黄藤素作为一种小分子，可直接与DNA 通过沟槽作用及嵌插作用相结合[9]，同时黄藤素能与蛋白质中的某些氨基酸的疏水键结合，充当酶的抑制剂[10]，因此具有良好的抗菌、抗病毒等生物活性[11-12]。除天然植物提取来源外，黄藤素也可以盐酸小檗碱为原料进行化学合成，且合成黄藤素的抗炎活性与天然黄藤素没有明显差异[13-14]。黄藤素的生理功能与其结构密切相关，据报道，C2和C3位置若是甲氧基（黄藤素），其对嗜热四膜虫的毒性大于C2 和C3 位置的亚甲二氧基的小檗碱，而甲氧基的抗菌活性更强[15]。而将黄藤素改性后的黄藤素衍生物的细胞毒性则会降低[16]。氯化黄藤素是黄藤素存在的主要形式之一，与黄藤素相比，氯化黄藤素具有良好的溶解性。但由于氯离子的存在，导致其吸湿性增强而稳定性变差，在空气中容易结块和潮解，对其运输、储存和临床药用效果有一定的影响。研究发现，有机酸盐蔗糖钠（SACNa）与离子型PAL 共晶，合成的PAL- SACNa药物盐吸湿稳定性显著提高[17]。

图1 黄藤素（A）及其游离碱8-羟基加合物（B）结构

2 黄藤素在动物肠道的吸收与体内代谢

黄藤素的吸收、代谢及在各组织器官中的分布是其在动物体内发挥生物学活性的基础。动物摄入黄藤素后，首先经过胃肠道，有一部分被肠道吸收后进入血液，并通过自身和其代谢产物影响其他组织器官。通过大鼠的灌胃试验发现，黄藤素在肠道各段均有吸收。灌胃0.5 h 后主要在十二指肠和空肠吸收，1～2 h 后主要被回肠吸收，且回肠的吸收效果较好[18]。研究显示，黄藤素通过血液循环进入体内，并在心脏、肾脏、脾脏、肝脏中分布；在肾脏、脾脏和肝脏中的含量较高，表明这些器官可能是黄藤素作用的靶器官[19]。静脉注射结果同样表明，黄藤素可到达大鼠的肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺脏、脑等不同组织，主要在肝脏和肾脏代谢，且部分经肝肠循环到达肠道参与微生物代谢，最后经粪便和尿液排出[20-21]。有研究发现，按60 mg/kg 的剂量对大鼠灌胃黄藤素，在2.8 h后血浆中的黄藤素浓度达到峰值，血药浓度最大为19.8 ng/mL，半衰期为6 h，其口服生物利用度为10.98%[22-23]。黄藤素生物利用度低的原因之一是其为P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）的底物[24]。P-糖蛋白广泛存在于肠道上皮细胞，其可将到达动物肠道过量吸收的异生素（如毒素或药物等）泵回肠腔，对动物起着保护作用，但同时这种保护机制也会增加治疗性药物的外排，降低药物的药效。研究发现，低浓度的黄藤素（2.5 μmol/L）能激活人结肠腺癌细胞(LS180)中P-gp 的活性[25]，而高浓度的黄藤素（100 μmol/L）对P-gp的活性没有明显影响[26]，因此，在特定浓度范围内使用黄藤素不会影响药物的肠道吸收。基于黄藤素是P-gp 的底物，研究发现，大肠杆菌诱导的仔猪肠道损伤和正常仔猪相比，对黄藤素的吸收没有改变，说明即使肠道在受损的情况下对黄藤素的吸收利用并不会改变[27]。因此，在考虑黄藤素的生物利用度时，除了考虑酸碱变化对药物的解离等物理性质的影响外，还应考虑肠道内P-gp影响。

黄藤素经肠道消化吸收后，一部分黄藤素会被代谢并通过尿液排出体外；另外一部分则会到达大肠，与肠道微生物发生相互作用，并经粪便排出。据报道，使用黄藤素灌胃大鼠后，在大鼠尿液、血浆、胆汁、肝脏组织及粪便中共鉴定出58 种黄藤素相关代谢产物，包括尿液中的46种代谢产物、血浆中的18种代谢产物、胆汁中的34种代谢产物、肝脏组织中的26种代谢产物和粪便中的10 种代谢产物，这58 种相关代谢产物分析表明，黄藤素在体内的Ⅰ期代谢途径是去甲基化和羟基化，Ⅱ期代谢主要包括葡萄糖醛酸化和硫酸化结合[28]。通过体外将黄藤素与大鼠、恒河猴和人肝微粒体共培养，同样发现葡萄糖醛酸化、羟基化以及硫酸化是黄藤素的主要代谢途径[29]。研究证明，药根碱（是一种源自黄连的原小檗碱生物碱，与黄藤素结构相似）的去甲基化和羟基化是由肝脏微粒体中的细胞色素（cytochrome，CY）P450 催化，其中CYP3A1/2和CYP2D2主要负责去甲基化[30]。在肝微粒体中添加黄藤素，其主要被CYP1A2 代谢[31]。在灌胃正常对照组大鼠和灌胃代谢综合征、急性肝炎试验大鼠黄藤素后，与正常大鼠相比，代谢综合征、急性肝炎大鼠血浆中的黄藤素药峰浓度和药时曲线下面积明显升高[32-33]，这可能是由于CYP450 在病理状态下活性降低的原因。将黄藤素与新鲜大鼠粪便共孵育后，共检测出黄藤素的10 种代谢产物，说明微生物也可代谢黄藤素[34]。斑马鱼体内肝脏和肾脏等组织均能检测到黄藤素的代谢产物，且主要经过Ⅰ期代谢9 种和Ⅱ期代谢10 种产物，这是由于黄藤素不同于其他原小檗生物碱，在C2，3 和C9，10 位置上具有开环结构，因此能够在Ⅰ期代谢后产生羟基化产物[35]。同时，肠道微生物也能代谢黄藤素，其代谢途径需要进一步研究，这也说明黄藤素能够与肠道微生物相互作用，可通过影响动物肠道微生物对动物产生影响。

3 黄藤素的生物学活性

3.1 抗炎作用

炎症反应是机体抵抗外来病原体、免受伤害的一种免疫防御性反应，炎症介质的表达体现了机体对病原体的抵抗能力，但越来越多研究发现过度肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化、代谢综合征与长期的慢性炎症往往密不可分[36]，因此，适度抑制炎症的发展对于机体的健康是必要的。研究发现，黄藤素具有良好的抗炎效果。在山羊子宫内膜上皮细胞（gEECs）中，黄藤素能通过降低上游通路中Toll 样受体（toll-likerecep‐tor4，TLR4）、TIR 结构域衔接蛋白（TIR-domain-con‐taining-adaptor-inducing IFN-β，TRIF）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表达缓解下游肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、IL-1β等促炎因子的分泌，但不改变MyD88的产生[37]。在小鼠巨噬细胞（RAW264.7）中，黄藤素能抑制IκB 的降解，阻止NF-κB活化进入核内转录IL-1β、TNF-α等促炎因子，但在RAW264.7细胞中TLR4和MyD88的表达以及脂多糖（LPS）与TLR4 的结合没有受到黄藤素影响[37-38]，说明黄藤素可能是依赖于TRIF 的信号传导而不通过MyD88发挥抗炎作用。研究发现，在LPS诱导的小鼠肺炎模型中，黄藤素可以抑制蛋白激酶B（pro‐tein kinaseB，Akt）/NF-κB 信号通路的激活，明显降低诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和IL-1β的表达，并且分子动力模拟显示，黄藤素能和Akt 存在结合位点且具有强烈的相互作用[39]。在小鼠乳腺上皮细胞中，黄藤素可以通过抑制Akt/NF-κB、胞外信号调节激酶（extracellular signal-regu‐lated kinases，ERK）和P38MAPK 信号通路下调下游炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达[40]。Akt参与细胞凋亡、细胞存活和炎症反应，也是维持动物基本生命活动的重要信号通路，Akt 的活化可使IκB 泛素化，激活NF-κB，还能促进一氧化氮（nitric oxide，NO）的释放，加速炎症的发展[41-42]。因此，黄藤素可能通过TLR4或Akt激活NF-κB通路，进而抑制炎症因子表达，降低炎症反应。炎症小体NLRP3在炎症的发生和发展中也起着一定的作用。研究发现，人急性单核白血病细胞中，黄藤素能显著抑制NF-κB通路中磷酸化的NF-κB抑制蛋白（p-Iκ）Bα蛋白表达，同时阻断NLRP3中Pro-Caspase-1和凋亡相关点样蛋白（ASC）的结合，降低NLRP3蛋白和Caspase-1蛋白的表达，减少IL-1β和IL-18的释放[43]。在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium Salt，DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中，研究发现，黄藤素同样可以抑制NLRP3 的激活，干扰Pro-Caspase-1 被剪切为Caspase-1，阻碍IL-1β、TNF-α等炎症因子的分泌[44]。因此，黄藤素可以抑制细胞质中NLRP3炎症小体的激活达到降低炎症反应的目的。然而，作为小分子的黄藤素是能够进入细胞，其对NF-κB通路及NLRP3炎症小体的作用是否仅通过细胞表面的TLR4进行传导信号，还是进入细胞后在细胞质内直接与NF-κB通路及NLRP3炎症小体发挥作用，或是进入细胞核与核酸结合发挥抑制炎症的作用仍需进一步探索。

3.2 抗氧化作用

氧化应激影响动物的健康，也是造成很多慢性病的重要原因。而黄藤素可通过激活核因子红系2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）通路提高动物体内抗氧化酶等抗氧化物质的含量，因此在一定程度上提高动物的抗氧化能力，促进动物的健康。黄藤素有良好的抗氧化活性，在体外，黄藤素能有效清除DPPH-、ABTS+、-OH 和NO 自由基[45]。在体内，黄藤素可以激活Nrf2 通路，Nrf2 是抵抗氧化应激的关键调节因子，正常情况下，Nrf2 与其抑制因子Kelch 样ECH 相关蛋白1（kelch-like ECH-associated‐protein1，Keap1）结合，存在于细胞质中保持无活性状态，当遭受氧化应激或暴露于活性氧（ROS）时，Keap1的半胱氨酸残基被氧化修饰并失去活性，被激活的Nrf2从Keap1-Nrf2复合物中释放出来进入核内，促进下游抗氧化基因，如血红素加氧酶-1（heme oxygen‐ase，HO-1）的表达[46-47]。研究发现，小鼠在灌服右旋糖酐硫酸钠盐（DSS）后，肠道有大量ROS 产生，黄藤素处理能有效活化Nrf2 并促进HO-1 的蛋白表达，并且内源性抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽（GSH）的水平显著上升[48]。在缺血/再灌注（I/R）诱导的小鼠氧化损伤模型中，Nrf2 的表达也被黄藤素激活，体内抗氧化酶水平显著提升[49]。此外，黄藤素还可以缓解口服阿霉素对身体产生的毒性，可能是因为黄藤素增加了体内总氧化物歧化酶（T-SOD）和CAT 的活性，显著降低了心脏中ROS、4-羟基壬烯醛（4-HNE）和丙二醛（MDA）的水平[50]。

3.3 调节糖、脂代谢

黄藤素对血糖和脂质的代谢具有双重作用。研究发现，黄藤素在体外能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性；在大鼠体内黄藤素能有效抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性，从而抑制葡萄糖、蔗糖、麦芽糖引起的血糖上升[51]。这可能是由于黄藤素通过影响胰腺细胞中丝裂原激活蛋白（MAPK）通路引起的血糖降低选择性抑制MAPK 介导的ERK[52]和c-Jun 氨基末端激酶[53]（c-Jun N-terminal kinases，JNK）通路可以缓解胰岛素抵抗和提高胰岛素敏感性。在高脂饮食诱导的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠葡萄糖耐量受损模型中，黄藤素显著抑制了MAPK 介导的ERK 和JNK信号转导，降低胰岛素抵抗并促进体内胰岛B细胞质量，减缓高脂饮食诱导大鼠的葡萄糖耐量受损[54]。此外，黄藤素还能有效降低脂质在体内的蓄积，体外试验发现，黄藤素处理能抑制3T3-L1脂肪细胞中的脂肪生成，从而减少脂滴在3T3-L1 脂肪细胞中的聚积，与完全分化的脂肪细胞相比，黄藤素显著下调了过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）的表达，抑制了脂肪的生成[55]。在饲粮中添加高脂和高胆固醇诱导小鼠高脂血症中，黄藤素处理小鼠体重显著低于未处理组，研究发现黄藤素通过下调胆固醇合成限速酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）的表达、上调低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）和胆固醇-7α-羟化酶（cholesterol-7α-hydroyyase，CYP7A1）的表达以及促进粪便中总胆汁酸的排泄来代谢和排泄胆固醇，加速脂质的清除[56]。黄藤素对抑制多糖的分解、提高胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗和减少脂肪在体内的蓄积有明显的效果，这为糖尿病及高血脂高胆固醇等疾病的药物筛选提供了新的参考。

3.4 调节肠道菌群平衡

肠道菌群与动物健康密切相关。一方面肠道菌群通过肠-脑轴、肠-肝轴、肠-肌肉轴等途径影响机体代谢与免疫[57]，一方面通过肠道优势菌群抵抗外来病原菌的入侵，当肠道菌群平衡受到破坏时，则会引起动物腹泻、营养吸收不良及免疫力下降等[58]。黄藤素对于恢复肠道菌群失调具有良好的效果。研究发现，大鼠摄入高脂饲粮后肠道菌群失调，黄藤素处理可以恢复高脂饲粮引起的肠道菌群丰度下降，减少有害菌，增加原有优势菌比例[59]。众所周知，使用抗生素容易导致肠道菌群失调，基于16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学分析，研究发现，黄藤素对于恢复抗生素诱导的小鼠肠道微生物群失调具有良好的效果[60]。在DSS诱导小鼠肠道菌群失调后，含有黄藤素的中药方剂也能恢复DSS诱导的菌群失调，降低有害菌比例调[61-62]，但是否是黄藤素发挥主要作用还有待进一步研究。

3.5 其他功能

除上述生物学功能外，黄藤素还具有缓解疼痛、抑菌和抗病毒的作用。嘌呤能2X7受体（P2X7 receptor，P2X7R）是一种嘌呤能受体，与慢性炎症和神经性疼痛之间存在密切关系[63]。通过外科手术结扎SD 大鼠眶下神经导致的眶下神经慢性收缩性损伤而建立的三叉神经痛（TN）模型，经注射黄藤素治疗后可显著降低P2X7R 的表达，降低TN 大鼠的机械疼痛敏感性[64]。黄藤素还可以通过阻断神经传递发挥镇痛作用，降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是一种伤害性神经递质，主要负责传递疼痛的作用[65]。研究发现，在TN大鼠模型中，黄藤素处理能显著抑制CGRP 及其受体的表达，缓解疼痛[66]。黄藤素对巨型芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌等也有一定的抑制作用，并且对革兰氏阳性细菌的抑制作用要明显强于革兰氏阴性细菌[67]。还有研究指出，黄藤素能有效抵抗呼吸道合胞病毒、寨卡病毒、西尼罗河病毒的感染，通过影响病毒的复制，阻碍病毒与宿主的结合方式，保护机体健康[68-70]。

4 黄藤素在生产中的应用

基于黄藤素的结构特点及代谢活性，其作为植物提取物在治疗肝脏相关疾病、炎症及腹泻等方面有相当广泛的应用。由于抗生素作为促生长型添加剂在动物养殖中禁用，越来越多的学者研究植物提取物作为抗生素替代物在动物养殖中的作用。而黄藤素以及含有黄藤素的植物成分在生产中也有一定的应用（见表1）。

表1 黄藤素在生产中的应用

5 小结

黄藤素具有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等多种生物学功能，在动物健康领域有着巨大的应用潜力。然而，目前还存在诸多问题，比如生物利用率，黄藤素是P-gp 的底物，不同物种、不同生理状态下的生物利用率最高的用药浓度还需确定，如何通过化学修饰提高黄藤素的生物活性及生物利用率还需进一步研究。黄藤素在生产中的应用研究相对较少，确定黄藤素在不同物种之间的具体作用靶点、作用机制、发挥效果如何，对于未来更好地应用于动物生产较为重要。