甘薯细胞色素P450单加氧酶基因IbCYP714E1和IbCYP714E2的鉴定及表达分析

何敏红,江梦真,陈善兰,孙宗建,朱宏波

(广东海洋大学 滨海农业学院,广东湛江 524088)

赤霉素(GAs)是重要的植物激素,在调控植物茎伸长、叶片扩张、开花、种子发芽和发育等各个方面都发挥着重要的作用[1-7]。关于植物赤霉素合成、代谢及信号转导的机制研究已经非常深入,相关基因在水稻、拟南芥等植物中已经被克隆[8-10]。高等植物通过控制GA的生物合成、失活和信号转导来调节活性GA水平。活性赤霉素(如GA1和GA4)的生物合成起始于牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP),由3种类型的酶催化,分别是萜烯合成酶(TPSs)、细胞色素P450单加氧酶(P450s)和2-酮戊二酸依赖双加氧酶(20DDs)。赤霉素(GAs)的失活涉及几个不同的机制:GA2氧化酶(GA2ox)可以将活性GAs(GA1和GA4)及其前体(GA20和GA9)的C-2位羟基化[9,11-12];水稻Eui基因编码的细胞色素P450单加氧酶OsCYP714D1可以通过16α,17-环氧化,使非C 13-羟基化的GAs(GA4、GA9和GA12)失活[13];拟南芥中,AtCYP714A1和AtCYP714A2蛋白被证明具有与水稻CYP714D1蛋白相同的功能[14],在毛白杨中,PtCYP714A3蛋白除了具备失活赤霉素的功能外,还同时参与植物对盐胁迫的响应[15];水稻的另外2个CYP714基因家族成员OsCYP714B1和OsCYP714B2编码 GA13氧化酶,能够将GA12的C-13位羟基化,是植物活性赤霉素失活的另外途径[16]。

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]属于旋花科甘薯属,具有耐贫瘠、抗性强、高产稳产、营养丰富等特性,是世界上重要的粮食、饲料、工业原材料作物。甘薯基因组测序工作的完成,为甘薯基因克隆和功能验证研究提供了方便[17-20]。CYP714基因家族方面的研究主要集中在拟南芥、水稻和毛白杨等植物中,在其他植物中很少有报道。本研究利用甘薯基因组和转录组数据,鉴定了2个CYP714基因,分别定名为IbCYP714E1和IbCYP714E2,对其进行了生物信息学分析,并通过实时定量PCR技术对2个基因在甘薯不同组织和不同非生物胁迫处理下的表达进行研究。本研究为探索甘薯CYP714基因在参与赤霉素代谢和抗性机制方面提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]品种‘济薯26’,分别于扦插后2个星期取叶(leaves,L)、茎(stem,S)、茎尖(stem tip,ST)和初生根(primary root,PrR),于扦插2个月后取花(flower,F)、果实(fruit,FR)、块根(tuberous root,TR)、柴根(pencil root,PR)。干旱和盐胁迫处理采取Hoagland营养液水培的方式种植培养,盐胁迫处理为200 mmol/L氯化钠(NaCl)、干旱胁迫处理为250 mmol/L甘露醇,处理时间为6 h和30 h,以Hoagland全营养液培养作为对照组(CK),取样部位为初生根,每个处理3次重复,液氮冷冻后-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1IbCYP714基因的鉴定及理化性质分析在甘薯基因组数据库(https://sweetpotao.com)获得的‘泰中6号’(I.batatas‘Taizhong 6’)基因组数据以及‘广薯87’全长转录组数据作为参考基因组进行比对及后续分析。以拟南芥CYP714蛋白序列为参考,利用TBtools软件中的BLAST程序从甘薯基因组搜索IbCYP714基因。同时利用获得的IbCYP714基因的氨基酸序列对其进行后续的理化性质分析。使用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)在线工具对IbCYP714蛋白分子量、等电点、亲水性等理化性质进行预测和分析。利用Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)进行亚细胞定位预测。根据甘薯基因组GFF注释信息,使用GSDS在线软件(http://gsds.gao-lab.org/)分析IbCYP714基因的外显子和内含子结构。

1.2.2 IbCYP714的进化分析根据已获得的拟南芥、水稻、毛白杨以及甘薯的CYP714氨基酸序列,使用MEGA7.0软件的ClustaW算法对拟南芥、水稻、毛白杨和甘薯CYP714氨基酸进行序列比对,采用邻接法(neighbor-joining,NJ),默认参数构建进化树。利用Swiss-Model网站对甘薯、水稻、拟南芥、毛白杨等CYP714蛋白质三级结构进行预测。

1.2.3IbCYP714基因启动子分析用Tbtools软件提取甘薯CYP714基因起始密码子CDS序列上游2 000 bp区域作为启动子并提交至在线软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare-/htm1)进行IbCYP714基因启动子顺式作用元件预测,对PlantCare分析结构进行筛选简化后,用TBtools软件对结果进行可视化。

1.2.4IbCYP714基因的表达分析使用Snapgene软件设计IbCYP714基因的引物,引物序列为IbCYP714E1(5′-GATCTCCAGGAGGCCACTTC-3′,5′-GCCTCTGCGCCTTCAAGAAC-3′)、IbCYP714E2(5′-GAGCCATGGCAAGACAAGTAC-3′,5′-CCGTTGGATGTGAGGATGCC-3′),交由生工生物工程(上海)公司进行合成,以ARF(5′-CTTTGCCAAGAAGGAGATGC-3′,5′-TCTTGT-CCTGACCACCAACA-3′)作为内参基因进行特异性表达分析。用Trizol法提取总RNA,再利用反转录盒(vazyme,南京)将RNA反转录合成cDNA,进行荧光定量PCR。采用2-ΔΔCT法[21]处理数据,每个样本技术重复3次,基因的相对表达量使用(平均值±标准差)表示。

2 结果与分析

2.1 基因理化性质分析

根据水稻和拟南芥CYP714基因保守序列,从甘薯基因组中鉴定出2个CYP714基因,定名为IbCYP714E1(OQ184947)和IbCYP714E2(OQ184948),分别位于甘薯第2和第3染色体,内含子数均为4个,开放读码框为1 554个和1 563个碱基,编码518个和521个氨基酸(图1和表1)。蛋白质理化分析结果表明:2个编码蛋白质分子量分别为58 036.42,57 881.43 kD,理论等电点分别为7.18、8.77,均为碱性蛋白,总平均亲水性(GRAVY)均为负值,为亲水蛋白,两蛋白被亚细胞定位于细胞质中(表1)。

表1 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因理化性质分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

图1 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因结构分析Fig.1 Structural analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene

2.2 系统进化分析及蛋白质三级结构预测

为进一步了解该基因蛋白的功能和进化特征,使用MEGA 7.0软件对甘薯CYP714蛋白与各参考物种CYP714蛋白序列进行比对,2个甘薯CYP714蛋白含有与水稻、拟南芥和毛白杨一致的保守结构域:氧结合和激活位点、ERR三联体基序和Haeme结合位点(图2,A)。2个甘薯CYP714蛋白三级结构与水稻OsCYP714D1(EUI)和OsCYP714B1蛋白三级结构相似(图2,B)。采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树。将甘薯、拟南芥、水稻和毛白杨CYP714蛋白聚为4个类群,2个甘薯IbCYP714蛋白与3个毛白杨PtCYP714E2、PtCYP714E4和PtCYP714E5蛋白聚为一个类群(图3)。

图2 IbCYP714E1和IbCYP714E2蛋白多序列联配及三级结构预测Fig.2 Multi-sequence alignment and tertiary structure of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

图3 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes

2.3 基因启动子顺式作用元件分析

通过对IbCYP714E1和IbCYP714E2基因启动子序列进行顺式作用元件预测,发现IbCYP714E1和IbCYP714E2基因除了含有通用顺式作用元件(CAAT)、核心启动子元件(TATA、TATA-box)外,还含有与光反应、植物激素调控、生物和非生物胁迫及与植物生长发育相关的转录因子等4种类型的顺式作用原件,说明甘薯CYP714基因可能参与到甘薯的生长发育及生物和非生物胁迫的应答和调控(图4)。

IbCYP714E1和IbCYP714E2基因启动子区域内的激素和逆境相关元件分布,不同颜色方框代表不同功能的元件。图4 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因启动子顺式作用元件分析Distribution of hormone- and stress-related elements in the promoter region of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene, and different colored boxes represent elements with different functions.Fig.4 Analysis of cis-acting elements of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 gene promoter

2.4 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在不同组织和非生物胁迫下的表达分析

2个基因在甘薯不同组织中的表达存在一定的差异,IbCYP714E1基因主要在叶片、柴根和初生根中表达量较高,而IbCYP714E2基因表达量较高的组织是柴根和花(图5)。

不同字母表示0.05水平上存在差异显著;*表示0.05水平上存在显著差异,**表示在0.01水平上存在极显著差异。图5 IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在不同组织和非生物胁迫下的表达分析Different letters indicate significant difference at the 0.05 level. * indicates significant difference at the 0.05 level, ** indicates highly significant difference at the 0.01 level.Fig.5 Expression analysis of IbCYP714E1 and IbCYP714E2 genes in different tissues and under abiotic stresses

水培条件下对初生根进行非生物胁迫处理,IbCYP714E1基因在干旱和盐胁迫6 h和30 h表达量均极显著高于对照。

IbCYP714E2基因在干旱胁迫下,2个时间段基因的表达量与对照没有显著差异,而盐胁迫下6 h表达量显著增加,30 h表达量与对照没有显著差异(图5)。

3 讨 论

植物CYP714基因属于细胞色素P450家族中的亚家族成员,在赤霉素代谢过程中具有重要的作用[22],水稻OsCYP714D1/Eui基因和拟南芥中的AtCYP714A1、AtCYP714A2基因编码GA 16α,17-环氧化酶,能够将GA12,GA9和GA4失活[13-14],水稻OsCYP714B1与OsCYP714B1编码GA13氧化酶,是另外一个重要的GA失活酶[16],毛白杨中的PtCYP714A3基因在水稻中过量表达后,除了降低水稻株高外,还能够提高水稻的抗盐能力。本研究鉴定到2个甘薯CYP714基因IbCYP714E1和IbCYP714E2具备模式植物CYP714基因亚家族的特征序列,启动子分析表明,2个基因的启动子区域均具备与光反应、植物激素调控、生物和非生物胁迫等结合原件,尤其IbCYP714E2基因具备赤霉素响应元件,说明这两个基因可能是甘薯赤霉素代谢的关键基因,同时可能参与甘薯抗逆性反应。

拟南芥中的2个CYP714基因被证明具有降解赤霉素的功能,基因的表达在组织上有叠加性和差异性[14],甘薯的2个CYP714基因也有类似结果,说明2个基因在调控甘薯赤霉素活性方面存在着一定的分工。IbCYP714E1主要在初生根、柴根和叶片上表达量较大,而IbCYP714E2主要在柴根和花中表达量较大,2个基因在不同类型根中的表达量的差异,说明它们在参与甘薯块根的分化过程中可能起到一定作用。2个基因均能受到干旱和盐胁迫的诱导,与启动子分析的结果吻合,同时也说明2个基因参与非生物胁迫的应答反应,这方面的研究与毛白杨PtCYP714A3基因的研究结果[15]比较接近,说明甘薯CYP714基因在非生物胁迫应答方面也发挥一定的作用。关于甘薯IbCYP714E1和IbCYP714E2基因在甘薯赤霉素代谢及非生物胁迫方面的分子机制,需要进行进一步的过表达和RNAi等方面的研究,本试验为甘薯赤霉素代谢机理和生理机制及相关性状分子育种研究提供了理论依据。