表面改性磁性纳米材料对吡咯喹啉醌的萃取性能研究

马 科，程源航

（郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450008）

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），化学名4,5-二羰基-1-吡咯-2,3-f-喹啉-2,7,9-三羧酸，可以参与氧化还原反应，还可参与脱氢、氧化、脱羧等。PQQ 可作为多种酶的辅因子，是继核黄素和烟酰胺之后第三类辅酶[1-2]。其广泛存在于自然界多种生命体，包括细菌、真菌、植物、动物等[3-6]。PQQ 对人体也具有多种生理功能，包括神经保护、促进生长发育、抑制氧化应激等[7-10]。2022 年被卫生健康委食品安全标准与监测评估司认定为“三新食品”，在医药、食品、健康等领域具有巨大开发潜力[11]。

目前从发酵液中分离纯化PQQ 的方法有阴离子交换树脂法、高效液相色谱法、络合萃取法、超分子溶剂萃取法等[12-16]。但以上方法均不适用于工厂大规模生产，故为了大规模发酵生产PQQ，必须解决分离纯化技术难题。

固相萃取技术在医药、化工、生物等多领域得到广泛应用，是目前天然产物分离纯化的热门技术[17-19]。而磁性固相萃取是基于固相萃取技术，使用磁性或可磁化材料为吸附剂的新型萃取技术[20-21]。磁性吸附剂不直接填充吸附柱，而是添加到溶液或悬浮液中，吸附分离目标物。然后，使用外部磁场将磁吸附剂从溶液中分离出来。再使用适当的溶剂洗脱目标物，并使用外部磁场将洗脱后的吸附剂从洗脱液中分离，实现目标物的分离[22]。

目前，磁性纳米材料用于PQQ 的固相萃取主要存在吸附性能差的问题。本文为突破PQQ 分离纯化难题，促进PQQ 新食品资源开发，拟通过研究不同表面改性的磁性纳米材料对PQQ 的吸附性能的影响，探索吸附性能与磁性纳米材料表面吸附位点不同官能团与PQQ 的分子相互作用力之间的内在规律，以期为解决PQQ 固相萃取磁性纳米材料吸附性能差的问题提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水乙醇、无水甲醇、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、四甲氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、葡萄糖、酵母粉、硫酸铵磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌、硫酸铜 分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；三氟乙酸、四氧化三铁纳米颗粒

分析级，百灵威科技有限公司；PQQ 标准品 色谱级，百灵威科技有限公司。

DF-101S 水浴锅 巩义于华仪器公司；电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器公司；超声恒温水浴SCQ-HD300A 上海声彦超声波仪器有限公司；磁力搅拌器 力辰科技有限公司；安捷伦1260 高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 磁性纳米材料的制备 为了开发高效吸附PQQ 的磁性纳米材料，本文根据材料表面吸附位点活性基团与目标物PQQ 分子间作用力大小不同，设计了以下三种表面改性方法，以期探索吸附性能与磁性纳米材料表面吸附位点不同官能团对PQQ 的分子相互作用力之间的关系。

1.2.1.1 材料1 合成方法 合成方法参考现有报道，但稍作修改[23]。将1.5 g 磁性四氧化三铁纳米颗粒通过超声，均匀分散到150 mL 无水乙醇中，加入1 mL超纯水，剧烈搅拌，加入300 μL 的四甲氧基硅烷，在30 ℃下，反应6 h。用磁铁获得修饰后的四氧化三铁纳米颗粒。干燥，密封保存。

1.2.1.2 材料2 合成方法 合成方法参考现有报道，但稍作修改[24]。将1.5 g 磁性四氧化三铁纳米颗粒通过超声，均匀分散到150 mL 无水乙醇中，加入1 mL 超纯水，剧烈搅拌，加入500 μL 的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，在30 ℃下，反应6 h。用磁铁获得修饰后的四氧化三铁纳米颗粒。干燥，密封保存。

1.2.1.3 材料3 合成方法 合成方法参考现有报道，但稍作修改[25]。将1.5 g 磁性四氧化三铁纳米颗粒通过超声，均匀分散到150 mL 无水乙醇中，加入1 mL 的超纯水，剧烈搅拌，加入2 mL 的十六烷基三甲氧基硅烷，在30 ℃下，反应6 h。用磁铁获得修饰后的四氧化三铁纳米颗粒。干燥，密封保存。取上述材料1 g 通过超声分散到20 mL 的10%十六烷基三甲基溴化铵溶液中，剧烈搅拌，30 ℃下，反应2 h。用磁铁获得修饰后的四氧化三铁纳米颗粒。干燥，密封保存。

1.2.2 磁性纳米材料对PQQ 的萃取性能研究 三种磁性纳米材料对PQQ 的吸附性能的对比：参考现有报道，但是具体条件有所改变[26]。本实验所需的PQQ 浓度为10～1200 mg·L-1，吸附实验均在pH6.5，磁性纳米材料添加量为10 g·L-1，混合时保证吸附剂均匀分散于溶液中，30 ℃下以转速200 r/min 震荡15 min，吸附完成后用磁铁将吸附剂与溶液分离，通过HPLC 测定剩余溶液中PQQ 的含量。

吸附量（Q，mg·g-1）通过以下公式（1）计算。

式中：C0（mg·L-1）和Ce（mg·L-1）分别是溶液中PQQ 的初始浓度和吸附后剩余浓度；V（mL）是PQQ 溶液的体积；m（mg）是磁性纳米材料的质量。

1.2.3 吸附动力学研究

1.2.3.1 吸附动力曲线 利用上述磁性纳米材料对PQQ 的吸附量的方法，在条件不变的情况下，在0、4、6、10、15、20、30、40、50、60 min 时间点各取三个样，测定吸附量和吸附率，并绘制吸附动力曲线。

1.2.3.2 吸附动力学模型的测定 通过选用文献报道的相关模型，包括准一级动力学模型（公式（2）），准二级动力学模型（公式（3）），和粒子内扩散模型（公式（4））研究PQQ 的吸附机理[27]。

式中：t（min）是吸附时间；qe和qt（mg·g-1）分别是平衡时间和时间t 时的吸附量；k1（min-1）和k2（g·mg-1·min-1）分别是伪一级动力学、伪二级动力学吸附速率常数；kd（g·mg-1·min-0.5）是内扩散速率常数；C（mg·g-1）表示边界层厚度。

1.2.3.3 吸附等温线研究 吸附等温线研究：通过Langmuir（公式（5）），Freundich（公式（6））和Tempkin（公式（7））分析实验数据[28]。

式中：ce是平衡时的吸附浓度（mg·L-1）；qe是平衡时的吸附容量（mg·g-1）；qmax是最大吸附容量（mg·g-1）；KL和KF是Langmuir 和Freundlich 模型的吸附速率常数；KT和f（L·mg-1）是Tempkin 常数和Tempkin 结合常数，分别反应吸附热和最大结合能。

1.2.4 解吸附研究 利用上述磁性纳米材料对PQQ 的吸附量的方法，吸附1 h 后，在条件不变的情况下，用以NaOH 溶液、甲酸、乙酸、氨水等为解吸剂进行解吸研究，在5、60、120 min 时间点各取三个样，测定解吸量和解析率。

利用磁性纳米材料对PQQ 的吸附量的方法，吸附1 h 后，在条件不变的情况下，选择上述步骤中解吸附最优的为解吸附剂进行解吸研究，在5、30、60、120、180 min 时间点各取三个样，测定解吸量和解析率。

1.2.5 HPLC 法检测PQQ 检测方法参考现有报道采用HPLC 法，但是具体条件有所改变[29]。对PQQ 进行全波长扫描，显示其在249 和330 nm 处有两个吸收峰，但在249 nm 处有最大吸收。以甲醇（A）-水（B）、千分之一三氟乙酸为流动相，利用反向C18色谱柱，测试吸收峰面积。按照所述色谱条件测定，峰面积（Y）与PQQ 浓度（X）的回归方程为Y=4629.59X-242.06，线性范围为0.5～5 μg/μL，决定系数R2为0.99936，PQQ 浓度与峰面积线性关系良好，以下关于PQQ 浓度检测均使用该标准曲线。

1.3 数据处理

本次试验中PQQ 含量检测数据均重复6 次，结果表示均以实验数据的平均值±标准偏差的形式呈现。采用Minitab 进行数据处理；采用Origin 2021进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 三种磁性纳米材料对PQQ 的吸附性能比较

为了选择对PQQ 吸附能力最强的改性磁性纳米材料，研究了三种表明改性磁性纳米材料对PQQ 的吸附能力。结果如图1 所示，经过四甲基硅烷表面修饰的材料1 对PQQ 吸附量最小，氨基硅烷化表面修饰的材料2 次之，而离子对硅烷化表明修饰的材料3 吸附作用最强，可达140.32 mg·g-1。后续实验选择烷基化磁性纳米材料作为吸附材料。现有研究表明，不同改性试剂改性后，材料表面活性吸附基团不同，活性基团对目标物的作用力越强，改性材料对目标物的吸附能力越强[30]。材料1 表面活性基团为甲氧基，其与PQQ 芳环氢之间的分子间相互作用力仅有较弱的范德华力，材料2 表面活性基团3-氨基丙基与PQQ 羧基之间有以甲氧基为供电子体的氢键作用力，以及活性基团甲氧基与PQQ 芳环氢之间的范德华力，材料3 表面活性基团为十六烷基、甲氧基、铵根离子，其与PQQ 分子间相互作用力有比较强的铵根离子与PQQ 羧基形成的离子键作用力，以及甲氧基为供电子体的氢键作用力和范德华力[31-32]。因此，可能由于材料3 表面吸附位点对PQQ 分子间相互作用力最强，材料2 次之，材料1 最弱，从而导致材料3 吸附量最大，材料1 吸附量最小。表面改性磁性纳米材料对PQQ 吸附能力与表面活性基团对吸附目标物的分子间相互作用力可能呈正相关。

图1 不同表面改性磁性纳米材料对PQQ 吸附的影响Fig.1 Effects of different magnetic nanomaterials on PQQ adsorption

2.2 材料3 对PQQ 吸附动力学研究

通过研究三种改性的磁性纳米材料对PQQ 吸附量，发现离子对烷基化表面修饰的材料3 吸附能力最大，因此进一步对其吸附PQQ 的吸附动力学进行了研究。

2.2.1 吸附动力曲线 对不同吸附时间材料3 对PQQ 的吸附量进行了检测，并绘制吸附动力曲线。结果如图2 所示，从该吸附动力学曲线可以发现，PQQ 在20 min 前吸附速率非常快，这是由于初始PQQ 浓度较高和磁性纳米材料表面空白吸附位点较多，随着表面吸附位点的减少，20～35 min 吸附速率减慢，直至50～60 min 达到平衡状态。PQQ 平衡时的最大吸附量为160.81 mg·g-1。因此后续选择吸附时间为50 min。

图2 吸附时间对材料3 吸附PQQ 的影响Fig.2 Effect of adsorption time on PQQ adsorption by material-3

2.2.2 吸附动力学模型 图3 显示了三种动力学模型模拟的结果，表1 显示了三种动力学模型的动力学参数。其中拟一级动力学模型的决定系数在0.9976～0.9982 范围内，拟二级动力学模型的相关系数为0.9803～0.9927，同时，拟一级模型计算的qe与实验吸附容量大致相符。这表明与拟二级动力学模型相比，拟一级动力学模型比较适合用于模拟该磁性纳米材料PQQ 吸附。图3C 显示三种浓度下的双线性，表明该纳米材料对PQQ 的吸附不止一个吸附过程，第一个吸附过程发生在0～30 min，属于快速吸附过程，纳米材料表面的吸附位点对PQQ 进行吸附，因为初始时表面活性位点较多，吸附速率快，随着吸附位点的减少吸附进入第二个阶段，PQQ 分子在纳米材料内部进行扩散，图中三条曲线都没有经过原点，表明粒子的内扩散不是唯一速率确定方式。

表1 吸附动力学各项参数Table 1 Various parameters of adsorption kinetics

图3 磁性纳米材料对PQQ 的吸附动力学模型Fig.3 Adsorption kinetic model of magnetic nanomaterials for PQQ

2.2.3 吸附等温线 采用三种模型对磁性纳米材料吸附PQQ 过程中等温曲线进行描述，得到如图4 所示数据，表2 为三种模型的参数总结。Lgangmuir 模型的R2=0.9989 远高于另外两种的拟合程度，因此磁性纳米材料对PQQ 的吸附更适合于Lgangmuir模型，表明PQQ 在磁性纳米材上的吸附适用于单层吸附，在吸附剂表面的吸附结合位点是均一的。

表2 吸附等温各项参数Table 2 Parameters of adsorption isotherm

图4 磁性纳米材料对PQQ 的等温线模型Fig.4 Isotherm model of magnetic nanomaterials for PQQ

2.3 解吸附研究

解吸附是将目标物从萃取材料上解吸释放的过程，是固相萃取的重要环节，解吸附率是考察萃取过程的重要指标。本文为了开发对PQQ 具有高效分离纯化性能的磁性纳米材料，除了吸附能力外，还考察了磁性纳米材料的解吸附性能。

2.3.1 解吸附溶剂 解吸附溶剂通过与吸附材料表面活性基团相互作用，从吸附材料替换目标物而使其解吸附。解吸附剂的性能主要通过解吸附率评价。研究结果如图5A 所示，氢氧化钠作为解吸附溶剂，解吸附率可达85.03%，效果最好，氨水次之，甲醇和乙酸基本没有解吸附作用。其原因推测为解吸附机制为离子交换解吸附，氢氧根离子交换PQQ 阴离子，而使其从材料表面解吸附出来。氨水碱性弱，无法完全交换。因此，随着氢氧化钠浓度的增加，离子交换越完全，解吸附效果持续升高，用质量浓度0.05%的氢氧化钠为解吸附溶剂，解吸附率可达85.13%，解吸附率与0.08%的氢氧化钠作为解吸附剂相比差异不明显。以上结果说明，使用浓度0.05%氢氧化钠作为解吸附剂效果最好。

图5 不同溶剂对磁性纳米材料解吸附的影响Fig.5 Effect of different solvents on desorption of magnetic nanomaterials

2.3.2 解吸附剂体积 为了考察解吸附剂体积对解吸附率的影响，研究了不同氢氧化钠溶液体积（图6）。随着氢氧化钠体积的增加，解吸附率逐渐增加，后趋于稳定。当氢氧化钠体积为8 mL 时，解吸附率最大为90.5%。氢氧化钠体积为4 mL 时，解析率已达到87%，故选择4 mL 为最适解吸附剂体积。

图6 氢氧化钠体积对解吸附的影响Fig.6 Effect of sodium hydroxide volume on desorption

2.3.3 解吸附时间 对不同时间PQQ 的解吸附（图7）研究结果表明，在0.1～1 h 期间，随着时间的增加，解吸附速率最快，此时结合到磁性纳米材料表面的PQQ 较多，容易解吸附，3 h 时解吸附率最大为87.0%，后随着时间的增加，解吸附增加较为缓慢，因为大多数PQQ 已经被洗脱，考虑到尽可能取最适解吸附率，因此选择3 h 为最适解吸附时间。

图7 解吸附时间对纳米材料解吸附的影响Fig.7 Effect of desorption time on desorption of nanomaterials

2.4 萃取材料的吸附重复性研究

萃取材料的重复使用性，是考察萃取材料实际应用的重要性能。本文对该材料的重复使用性进行了研究。结果如图8 所示，材料循环使用5 次，吸附量由初次使用时的160.81 mg·g-1（见2.2.1）下降到145.96 mg·g-1，仅仅下降9.23%，表明该材料具有较好的重复使用性。

图8 萃取材料的吸附重复性研究Fig.8 Adsorption repeatability of extraction materials

3 结论

本文制备了3 种表面改性磁性纳米材料，并研究了这3 种材料对吡咯喹啉醌的萃取吸附性能，发现材料3 表面活性基团铵根离子与PQQ 羧基形成的离子键作用力，以及甲氧基为供电子体的氢键作用力和范德华力，对PQQ 的分子相互作用力最强，吸附量最大。其最适解吸附剂为0.05%氢氧化钠，解吸附3 h，最大解析率达87.00%。材料用于吸附、解吸附的重复使用性较好，连续使用5 次以上吸附量仅下降9.23%。总之，本文探索了表面改性对磁性纳米材料PQQ 吸附性能的影响规律，为PQQ 固相萃取材料开发具有一定的理论指导意义。但是，本文吸附与解吸附是在PQQ 纯品溶液中进行，为了验证该材料能否大规模用于PQQ 的分离纯化工艺，下一步需要研究利用该材料从发酵液中萃取分离PQQ 的性能，以期开发高效分离纯化PQQ 的磁性固相萃取技术。