好食脉孢霉固体发酵玉米麸皮产阿魏酰低聚糖工艺优化

肖 凯，邓永平,2, ，刘宇驰，刘晓兰,2，王 燕,2，赵 雨,2

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006）

阿魏酰低聚糖（Feruloylated oligosaccharides，FOs）由阿魏酸的羧基与低聚糖的羟基通过酯键连接构成，经肠道消化后可释放阿魏酸和低聚糖，具有较游离阿魏酸更强的抗氧化、调节肠道菌群等多种生理活性[1-4]。2010 年美国食品药品监督管理局批准可将麦麸中提取的FOs 添加到食品中（GRAS NOTICE 000343）。

我国玉米产量位居世界第二，2022 年达到2.77亿吨，其中约25%用于深加工生产玉米淀粉、乙醇等。玉米麸皮是玉米湿法加工生产淀粉的副产物，资源丰富[5]。玉米麸皮含粗蛋白约10%、淀粉10%～20%、粗脂肪约6%、纤维10%～20%、半纤维素30%～40%，含阿魏酸约3%[6-7]。目前主要直接作为饲料原料使用，也有少量报道利用玉米麸皮的可发酵性研制发酵饲料，但是仍存在附加值较低的问题[8]。研究表明，玉米麸皮中含13%～18%的阿拉伯木聚糖以及3%左右的阿魏酸[9-10]，经过水热预处理与酶水解结合法、离子液体预处理与酶水解结合法、微生物发酵法均可水解其糖苷键提取FOs[11-15]。与其他方法相比，采用安全微生物发酵玉米麸皮生产FOs，不仅产物安全性高、成本较低，还能提高膳食纤维等其他功效成分的含量。焦昆鹏等利用平菇发酵玉米麸皮生产FOs，培养8 d 后发酵液中FOs 含量为12.515 μmol/L[15]。但是目前以玉米麸皮为原料发酵生产FOs 的研究较少，亟需开拓发酵新工艺，以提高FOs 产量，缩短发酵时间，提高玉米麸皮附加值。

好食脉孢霉（Neurospora sitophila）是“一般认为安全”（Generally recognized as safe，GRAS）真菌，该菌在农产品加工副产物（如麸皮、豆渣等）中生长速度快、代谢旺盛，代谢产物含纤维素酶、木聚糖酶等多种水解酶，对植物纤维类底物具有较强降解能力，同时其气生菌丝体和孢子中富含类胡萝卜素[16-18]。前期研究发现分离自北方发酵豆制品中的好食脉孢霉菌株在玉米麸皮培养基中生长周期短，FOs 含量相对较高，具有较大开发价值，本文采用单因素和响应面法对其固体发酵玉米麸皮产FOs 的条件进行了优化，以期为提高玉米麸皮生物利用率和附加值提供基础，为微生物发酵法生产FOs 提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

好食脉孢霉（Neurospora sitophila） 分离自我国北方发酵豆制品，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCC No.1836；所用试剂均为国产分析纯 天津市凯通化学试剂有限公司。

ZHJ-C2109C 型超净工作台 上海智城分析仪器有限公司；SPX-150BS-Ⅱ型生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；冷冻离心机（CF15RX） 日立（中国）有限公司；分光光度计（TU-1901） 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养方法 斜面培养：将4 ℃保存的好食脉孢霉菌株转接到PDA 培养基中，在28～30 ℃培养72～120 h，PDA 培养基的配制方法见参考文献[19]。

孢子悬液制备方法：取4 ℃斜面保存的好食脉孢霉菌株，注入无菌水，用接种环轻刮使孢子散落后回到入装有玻璃珠和无菌水的三角瓶中，150 r/min振荡10 min，使孢子分散，用普通光学显微镜计数。

固体发酵：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麸皮，加水量15 mL，在121 ℃灭菌30 min，冷却后接种好食脉孢霉孢子悬液，接种量为1×106个孢子/瓶，在28 ℃条件下培养72 h。

1.2.2 发酵工艺优化

1.2.2.1 单因素法优化发酵工艺条件 氮源种类对FOs 含量的影响：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麸皮，分别添加玉米麸皮质量2%（w/w）的豆粕、玉米胚芽粕、玉米蛋白粉和硫酸铵作为氮源，对照组以等量玉米麸皮代替氮源，培养基加水量为15 mL，接种量为1×106个孢子/瓶，在28 ℃条件下培养72 h 后测定FOs 产量。

氮源添加量对FOs 产量的影响：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麸皮，调节培养基中豆粕浓度分别为玉米麸皮质量的1%、2%、3%、4%、6%、8%和10%（w/w），加水量为15 mL，接种量为1×106个孢子/瓶，28 ℃培养72 h 后测定FOs 产量。

接种量对FOs 产量的影响：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麸皮、玉米麸皮质量2%（w/w）的豆粕，加水量为15 mL，接种量分别1×104、1×105、1×106、1×107个孢子/瓶，在28 ℃培养72 h 后测定FOs 产量。

发酵温度对FOs 产量的影响：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麸皮、玉米麸皮质量2%（w/w）的豆粕，加水量为15 mL，接种量为1×105个孢子/瓶，分别在25、28、31、34 ℃培养72 h 后测定FOs 产量。

发酵时间对FOs 产量的影响：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麸皮、玉米麸皮质量2%（w/w）的豆粕，加水量为15 mL，接种量为1×105个孢子/瓶，在28 ℃分别培养48、72、96、120、144 h 后测定FOs 产量。

加水量对FOs 产量的影响：250 mL 三角瓶中添加5 g 玉米麸皮、玉米麸皮质量2%（w/w）的豆粕，加水量分别为5、10、15、20、25 mL，接种量为1×105个孢子/瓶，在28 ℃培养72 h 后测定FOs 产量。

1.2.2.2 响应面优化试验 在单因素实验基础上，利用Design-Expert version 13 软件设计4 因素3 水平的响应面优化试验，以FOs 产量为响应值进行试验，试验因素水平设计见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.3 玉米麸皮FOs 提取和含量测定 发酵结束后，取固体发酵样品置于烘箱中于45 ℃烘干48 h，将烘干样品进行粉碎，取干燥发酵产物以料水比为1:100（g/mL）混合，在水浴锅中80 ℃浸提30 min，冷却离心（5000 r/min，10 min），取上清备用。采用双波长法测定上清液中FOs 浓度[20]，计算方法如下：

式中：A345表示波长345 nm 处的OD 值；A375表示波长375 nm 处的OD 值；b 表示比色皿的厚度，1 cm；C1表示阿魏酸的浓度，mol/L；C2表示阿魏酸低聚糖的浓度，mol/L。

1.3 数据处理

用Microsoft excel 2016 和SPSS 26.0 进行单因素ANOVA 检验，采用多项式对比、方差齐性检验和Duncan 氏法进行多重比较。P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。利用Design-Expert version 13 软件进行响应面试验设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 氮源种类对FOs 产量的影响 玉米麸皮含丰富的碳源，为满足好食脉孢霉生长代谢产FOs，需要适量补充氮源。以未添加氮源为对照，分别研究添加豆粕、玉米胚芽粕、玉米蛋白粉、硫酸铵对好食脉孢霉发酵产FOs 的影响，结果见图1。

图1 不同氮源对FOs 含量的影响Fig.1 Effects of different nitrogen sources on FOs content

如图1 所示，以豆粕为氮源时发酵产物中FOs产量显著高于其他氮源和对照（P＜0.05），以玉米胚芽粕和玉米蛋白粉为氮源时FOs 产量较低，以硫酸铵为氮源时FOs 产量最低。玉米蛋白粉含粗蛋白约60%，显著高于豆粕（约40%），但是主要由醇溶蛋白和谷蛋白构成，水溶性较差，另外，氨基酸组成不平衡，赖氨酸不足[21]，使好食脉孢霉生长代谢不旺盛，导致FOs 产量相对较低，这与植物乳杆菌发酵产细菌素、鱼酱发酵受赖氨酸影响相似[22-23]；硫酸铵虽是速效氮源，能为菌株生长提供氮素，但是相比对照组（玉米麸皮等量代替硫酸铵）和其他氮源来说，其营养成分较单一，使菌株生长状态不佳，FOs 产量也最低，这与好食脉孢霉发酵醋糟产类胡萝卜素的研究结果相似[24]。综上，确定发酵培养基氮源为豆粕。

2.1.2 豆粕添加量对FOs 产量的影响 豆粕添加量对好食脉孢霉发酵产FOs 的影响见图2。

图2 不同豆粕添加量对FOs 含量的影响Fig.2 Effect of different soybean meal content in medium on FOs content

如图2 所示，随着豆粕添加量的提高FOs 产量呈先增加后减小的趋势。微生物的生长代谢需要适宜的营养物质比例，发酵培养基中氮源浓度较低，导致菌体生长速度缓慢；氮源浓度过高，培养环境营养物质比例失衡，会导致菌体代谢不平衡，生长缓慢[25]。当培养基中豆粕添加量为玉米麸皮质量的2%（w/w）时，发酵产物种FOs 含量显著高于其他豆粕浓度（P＜0.05）。所以，确定培养基中豆粕浓度为玉米麸皮质量的2%（w/w）。

2.1.3 发酵条件对FOs 产量的影响

2.1.3.1 接种量对FOs 产量的影响 接种量是影响发酵的主要因素，接种量不足会使底物转化为产物的速度缓慢，生产周期延长，接种量过大则会使底物快速消耗，培养环境改变，从而影响菌株生长代谢[26]。接种量对好食脉孢霉发酵产FOs 的影响见图3。

图3 不同接种量对FOs 含量的影响Fig.3 Effects of different inoculation sizes on FOs content

如图3 所示，接种量1×104个孢子/瓶时，FOs 生成量低；接种量较高时，菌体浓度高，营养物质消耗速率快，代谢产物的积累使环境条件发生改变，影响菌体的生长代谢，导致FOs 的产量低。当接种量为1×105个孢子/瓶时，玉米麸皮FOs 产量显著高于其他接种量（P＜0.05）。因此，确定接种量为1×105个孢子/瓶。

2.1.3.2 发酵温度对FOs 产量的影响 发酵温度对好食脉孢霉发酵产FOs 的影响如图4 所示，随着玉米麸皮发酵温度的提高，玉米麸皮FOs 产量的趋势是先上升后下降。可能是由于温度较低时，菌种生命速度缓慢，而当温度超过菌株最适生长温度时，菌株的生长繁殖受抑制，进而影响到FOs 的产量。当温度为28 ℃时，玉米麸皮FOs 产量有最大值，显著高于其他温度（P＜0.05）。所以，确定发酵温度为28 ℃。

图4 不同发酵温度对FOs 含量的影响Fig.4 Effect of different fermentation temperatures on FOs content

2.1.3.3 发酵时间对FOs 产量的影响 发酵时间对好食脉孢霉发酵产FOs 的影响如图5 所示，随着时间的延长玉米麸皮FOs 产量呈现先上升后下降的趋势，培养初期，培养基中营养物质丰富，微生物代谢旺盛，FOs 产量显著上升；当发酵3 d 时，玉米麸皮FOs产量（1.42 μmol/g）有最大值，显著高于其他发酵时间（P＜0.05）；发酵3 d 后，随着培养时间的延长，由于营养物质的消耗和代谢物的积累，培养环境可能不适宜菌体的生长代谢，释放的FOs 被进一步降解。因此，确定培养时间为3 d。与平菇液体发酵玉米麸皮产FOs（发酵8 d，FOs 产量为12.515 μmol/L）[15]和出芽短梗霉发酵小麦麸皮产FOs（发酵84 h，FOs 产量为1.123 μmol/L）[27]相比，好食脉孢霉固体发酵产FOs 的发酵时间较短。

图5 不同发酵时间对玉米麸皮FOs 含量的影响Fig.5 Effect of different fermentation time on FOs content

2.1.3.4 加水量对FOs 产量的影响 加水量对好食脉孢霉发酵产FOs 的影响如图6 所示，在实验范围内随培养基加水量的增加FOs 的产量呈先增加后减少的趋势，当培养基加水量为15 mL 时FOs 产量最高（P＜0.05）。固态发酵培养基含水量会对培养基的孔隙率产生影响，进而影响培养基的溶氧量、散热性、粘稠度以及培养基与氧气的接触面积，从而对菌体生长产生影响[28-29]。本研究中较高的加水量使培养基变得粘稠，氧气与菌体接触面积下降，影响了菌体代谢。因此，确定培养基加水量为15 mL。

图6 不同加水量对FOs 含量的影响Fig.6 Effects of different water additions on FOs content

2.2 响应面优化试验

利用单因素实验获得的培养条件最优结果作为设计各因素水平区间的依据，以FOs 的产量为响应值，对显著影响好食脉孢霉固体发酵制备FOs 的培养条件，包括加水量（A）、接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）进行了优化，实验结果见表2。

表2 响应面试验设计和结果Table 2 Design and result of response surface experiment

利用Design Expert 13 软件对表2 中的结果进行回归拟合，得到FOs 含量（Y）对A（加水量）、B（接种量）、C（发酵温度）、D（发酵时间）的多项回归方程：

由表3 可知，回归方程模型P＜0.0001，表明模型具有极显著性；回归方程失拟项P＞0.05，不显著，表明回归模型是可靠的；拟合度R2=0.9322，说明拟合值与实际值显著相关，模型精确度满足要求；校正系数R2adj=0.8644，说明该模型能解释86.44%响应值的变化。由方差分析得到4 个因素对玉米麸皮FOs 产量的影响为：接种量（B）＞发酵时间（D）＞加水量（A）＞发酵温度（C）。一次项B 和二次项A2、B2、C2、D2对FOs 含量影响极显著（P＜0.01），一次项D对FOs 含量影响显著（P＜0.05）。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Results of variance analysis of response sueface quadratic model

根据加水量、接种量、发酵温度和发酵时间四个因素交互作用与响应值的关系得出三维响应面图，结果见图7。

图7 两因素交互作用对FOs 含量影响Fig.7 Effect of the interaction between two factors on the water content of FOs content

响应面曲面坡度越陡峭，等高线图越偏椭圆形，因素之间的交互作用则越显著，反之则表示两因素间的交互作用不显著。由图7 可知，图7（e）的曲面坡度陡峭程度高于其它各组，等高线也相对密集，表明接种量（B）和发酵时间（D）的交互作用对FOs 产量的影响高于其它组合对Fos 的影响，与方差分析结果一致。

回归方程求解后得知四个因素的最优值分别为：加水量15.15 mL、接种量1.17×105个孢子/瓶、发酵温度27.91 ℃、发酵时间75.09 h。结合实际，将上述优化后发酵条件调整为：加水量15.2 mL、接种量1.17×105个孢子/瓶、发酵温度28 ℃、发酵时间75 h。用优化后的条件制备FOs，进行9 组平行试验，产量为（1.52±0.02）μmol/g，与模型预测的理论值（1.56 μmol/g）接近，表明该模型可以较好地指导好食脉孢霉固体发酵玉米麸皮生产FOs。

响应面法是优化发酵工艺的有效方法之一，卜雯丽等通过响应面法优化了出芽短梗霉固态发酵啤酒糟制备阿魏酰低聚糖的工艺，优化后阿魏酰低聚糖含量提高至37.67 μmol/L[30]；陈秋燕等利用响应面试验优化了枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母混合发酵麦麸产阿魏酰低聚糖的工艺，优化后其产量（1273.18 nmol/g）较优化前提高了94%[31]。在本研究中采用响应面法优化阿魏酰低聚糖生产工艺是可行的，阿魏酰低聚糖产量较优化前提高了60.83%。

3 结论

本文对GRAS 菌株好食脉孢霉固体发酵玉米麸皮制备阿魏酰低聚糖的培养基组成和培养条件进行了优化，结果表明：发酵培养基由玉米麸皮5 g 以及玉米麸皮质量2%（w/w）的豆粕组成，加水量为15.2 mL，接种量为1.17×105个/瓶，发酵温度为28 ℃，发酵时间为75 h。在优化后的条件下FOs 产量为（1.52±0.02） μmol/g，较优化前产量（0.94±0.03）μmol/g 提高60.83%。本文采用的固体发酵方法是对农产品的工业加工副产物资源化、高值化利用的有效途径，采用该方法生产FOs 对于提升玉米麸皮附加值、延长玉米产业链、增加玉米加工企业经济效益具有较大的意义，同时为FOs 的发酵生产提供新方法。后续需要针对玉米麸皮生产的FOs 的表征及在食品或饲料领域的进一步应用开展研究。