CDCA5、miR-146a、S100A7水平与过敏性鼻炎严重程度的关系及其临床价值*

石 昊,薛 媛,安 丽,闫 娟,拓明祥,李二乐

陕西省延安市人民医院耳鼻咽喉头颈外科,陕西延安 716000

过敏性鼻炎(AR)又称变应性鼻炎,是一种鼻黏膜非感染性炎症疾病,全球发病率较高[1-2]。目前AR诊断主要依据患者临床症状、体征及过敏原检测等方法,但用于AR早期诊断及判断预后的客观指标很少。因此探讨AR的发病机制,找寻能够有效评估AR病情的敏感指标,对临床诊治具有重要意义。细胞分裂周期相关蛋白5(CDCA5)是一种新的癌基因,近年来,有研究发现CDCA5水平升高与哮喘的发生及疾病严重程度关系密切[3-4]。AR在发病机制、病理改变方面很大程度上与哮喘相似,但CDCA5与AR关系的相关报道有限,探讨CDCA5与AR的关系是AR研究的一个新分子靶标。微小RNA-146a(miR-146a)是可调节机体免疫系统的miRNAs,可参与炎症调节,在炎症反应、固有免疫及癌症进展等生物学过程中发挥重要作用[5]。研究发现,miR-146a水平异常与AR病理特征及病情程度显著相关,是诊断AR有效的分子标志物[6]。S100钙结合蛋白A7(S100A7)是近年基于蛋白质组学技术在AR鼻腔分泌物中发现的特异性蛋白质标志物,有研究报道S100A7能够特异性识别Ca2+结合位点,趋化CD4+T淋巴细胞参与细胞炎症反应与细胞免疫功能调控,与多种炎症疾病及心血管疾病的发生有关[7-8],为AR的诊治提供了新的思路。但目前有关S100A7与过敏性疾病关系的研究报道较少,故S100A7参与调控AR发生的作用机制需进一步研究分析。因此,本研究通过检测AR患者外周血中CDCA5、miR-146a及鼻腔分泌物中S100A7水平,分析了这3项指标与AR病情严重程度的关系及其对AR的临床诊断价值,以期为AR的临床诊治提供更多分子标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性选取2019年7月至2022年3月本院收治的AR患者83例作为观察组,其中男46例、女37例,平均年龄(35.5±5.7)岁,平均体质量指数(BMI)为(23.2±2.3)kg/m2。另选取同期在本院体检且无过敏性疾病和呼吸道相关疾病的健康人50例作为对照组,其中男31例、女19例,平均年龄(36.3±6.2)岁,BMI为(22.7±2.5)kg/m2。纳入标准:年龄>18岁;AR诊断符合《中国变应性鼻炎诊断和治疗指南(2022年,修订版)》[9]中的相关标准;近1个月内未使用过抗过敏、抗组胺及免疫治疗等药物;未合并肝肾功能障碍、免疫系统性疾病及恶性肿瘤等;临床资料完整。排除标准:其他类型过敏性疾病;近期患有急慢性感染性疾病;伴有鼻窦炎、鼻息肉等其他鼻部疾病;合并HIV感染、结核病等。两组患者性别、年龄、BMI等一般基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有受试者对本研究知情,并签署知情同意书。本研究获得本院医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1AR病情评估 根据2015年《变应性鼻炎诊断和治疗指南》[10]的相关要求,采用四分法对鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕4个症状进行评估:0分为无症状;1分为症状较轻,易于忍受;2分为症状明显,但可以忍受;3分为症状无法忍受,影响日常生活/睡眠。各项评分之和即为总分,总分0～12分,总分≤6分为轻度,>6分为中重度。

1.2.2外周血CDCA5、miR-146a水平检测 采集两组受试者外周静脉血各4 mL,均分为2份,肝素抗凝,保存待测,采用实时荧光定量PCR进行检测。(1)CDCA5水平:取待测血样1份,加入细胞分离液,2 000 r/min离心20 min,得到淋巴细胞。采用Trizol法提取细胞总DNA,检测RNA水平,反转录合成cDNA,以此为模板按照CDCA5检测试剂盒说明书配置RNA反应体系。反应条件:95 ℃ 60 s,65 ℃ 30 s,75 ℃ 15 s,循环40次。以GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算CDCA5水平。(2)miR-146a水平:取待测血样1份,通过密度梯度法提取单个核细胞,方法同上提取细胞悬液总DNA,反转录合成cDNA,按照miR-146a检测试剂盒说明书配置RNA反应体系。反应条件:95 ℃ 60 s,95 ℃ 45 s,75 ℃ 30 s;循环40次。以β-actin为内参基因,采用2-ΔΔCT法计算miR-146a水平。CDCA5、miR-146a引物均由上海基康公司设计合成。

1.2.3鼻腔分泌物中S100A7水平检测 用无菌枪状镊夹取无菌干燥脱脂棉2.5 cm×1.0 cm×0.5 cm,置入受试者一侧鼻腔,贴放于下鼻甲处,放置10 min后取出,收集患者鼻腔分泌物于低温保存待测。取鼻腔分泌物标本解冻,室温3 000 r/min离心10 min,取上清液,严格按照试剂盒操作说明采用酶联免疫吸附试验检测鼻腔分泌物中S100A7水平。

1.3观察指标 观察两组外周血CDCA5、miR-146a及鼻腔分泌物中S100A7水平,并分析其与AR病情严重程度的相关性及其对AR的诊断效能。

2 结 果

2.1两组CDCA5、miR-146a、S100A7水平比较 观察组CDCA5水平高于对照组,miR-146a及S100A7表达水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组CDCA5、miR-146a、S100A7水平比较

2.2不同程度AR患者CDCA5、miR-146a、S100A7水平比较 入组AR患者病情症状得分为2～11分,平均(6.53±1.14)分,其中轻度组34例、中重度组49例。中重度组AR患者CDCA5水平高于轻度组,而miR-146a、S100A7水平低于轻度组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同程度AR患者CDCA5、miR-146a、S100A7水平比较

2.3CDCA5、miR-146a、S100A7水平与AR病情严重程度的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示,CDCA5水平与AR病情严重程度呈正相关(r=0.637,P<0.05),miR-146a、S100A7水平与AR病情严重程度呈负相关(r=-0.596、-0.605,P<0.05)。

2.4CDCA5、miR-146a、S100A7水平对AR的诊断效能 ROC曲线结果显示,CDCA5、miR-146a、S100A7单独诊断AR的曲线下面积(AUC)分别为0.778、0.784、0.806,而3项指标联合诊断AR的AUC为0.897、灵敏度为87.9%、特异度为83.6%。见表3、图1。

图1 CDCA5、miR-146a、S100A7单独及联合检测诊断AR的ROC曲线

表3 CDCA5、miR-146a、S100A7单独及联合检测对AR的诊断效能

3 讨 论

AR是常见的上呼吸道慢性疾病,以鼻黏膜慢性炎症为主要特征,目前其发病机制尚不明确,但有研究显示其与鼻黏膜产生的过度免疫反应激活了炎症因子和免疫球蛋白E(IgE)释放有关[2]。AR发病的病理基础是免疫反应,免疫失衡引起的炎症因子大量释放会加重AR病情[2]。目前,AR临床治疗方法较多,但治疗整体效果不理想,部分患者病情控制不佳。因此积极探讨AR发病机制及找寻有效的临床分子标志物对评估AR病情及指导临床治疗意义重大。

CDCAs基因家族是调控细胞分裂周期过程的关键基因,其家族基因异常会造成细胞生长失控,通过促进肿瘤细胞增殖、调节细胞周期、减少细胞凋亡,介导肿瘤的发生[3,11]。CDCA5是CDCA基因家族成员,研究发现,CDCA5水平在人类多种肿瘤中上调,与肿瘤恶性进展及患者预后相关[12-13]。有研究显示,AR进展为过敏性哮喘的发生率达20%～30%,而哮喘患者伴AR的发生率高达60%～78%[14]。王麒淇等[4]、黄辉等[15]研究发现,哮喘患者及AR伴哮喘综合征患者外周血中CDCA5水平明显升高,但CDCA5水平与AR的关系研究报道较少见。鉴于AR和哮喘在病因及病理改变等方面相似性较高,主要区别在于症状体征和发病部位不同,因此本研究分析了CDCA5在AR中的水平,结果发现AR患者外周血中CDCA5水平升高,且与病情严重程度呈正相关(P<0.05),提示CDCA5可能参与AR的发病,但其调控AR发生的作用机制需进一步研究。

miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的非编码小分子RNA,大量研究表明,miRNAs在许多生理过程中起着关键作用,参与调节多种疾病的发病机制,如肿瘤、自身免疫性疾病、炎症及其他类型疾病等[5,16]。赵磊等[17]发现,miRNAs水平异常可导致免疫紊乱,激发炎症反应,为过敏性疾病的发病研究和治疗提供了新思路。相关AR小鼠模型中,miR-146a能够诱导转化生长因子-β产生,诱导CD4+T淋巴细胞向Treg细胞分化[18]。miR-146a能够降低AR小鼠体内IgE及炎症细胞因子水平,发挥抗炎作用[19]。AR患者中miR-146a水平降低,并通过调节信号转导和转录激活因子5b水平发挥免疫负调节反应功能,参与Treg细胞分化及功能维持,参与AR的发生、发展[20]。而本研究发现,miR-146a水平与AR病情严重程度呈负相关(P<0.05),与王忠勋等[21]研究结果一致。

有研究表明,S100蛋白与肿瘤上皮间质转换及肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等过程相关,而当其分泌到细胞外时,通过组织修复及免疫调节等途径,可影响局部炎症细胞及肿瘤细胞的活动,参与炎症反应[8,22]。S100A7是S100蛋白家族的一员,正常情况下当鼻腔受微生物病原菌刺激时,鼻腔上皮细胞会产生S100A7蛋白,吸引免疫功能细胞发挥抗菌防御作用。有研究发现,与健康人相比,AR患者鼻腔灌洗液中S100A7水平明显降低,考虑与机体抗菌防御功能受损有关[23]。过敏性疾病的发病可能与S100A7水平降低使细胞免疫能力降低,从而引起感染扩散或微生物定植有关[24]。目前,S100A7水平与过敏性疾病的发病关系研究尚无明确定论,但其在过敏性疾病中的表达特性为AR的临床诊治提供了新的研究靶点。本研究发现,中重度组AR患者鼻腔分泌物中S100A7水平明显低于轻度组(P<0.05),与文献[23-24]研究结果一致,本研究还发现,S100A7与AR病情严重程度呈负相关(r=-0.605,P<0.05)。ROC曲线结果显示,CACD5、miRNA-146a、S100A7诊断AR的AUC分别为0.778、0.784、0.806,而3项指标联合诊断的AUC为0.897,明显高于各指标单独检测。

综上所述,AR患者外周血中CDCA5、miR-146a水平及鼻腔分泌物中S100A7水平与AR病情密切相关,且3项指标联合检测能提高AR的临床诊断效能,对评估患者病情及指导临床诊治具有重要意义。