火针对膝骨性关节炎模型大鼠血清TNF-α及软骨组织p38的影响 *

万 甜 蓝枰英 石欣悦

（1.福建医科大学附属第二医院康复医学科，福建 泉州 362000；2.福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122）

骨性关节炎是一种好发于中老年人的慢性退行性骨关节疾病，我国65 岁以上人群的患病率高达50%，其病变可累及多个部位，其中以膝关节受累最为多见［1］。膝骨性关节炎（Knee osteoarthritis，KOA）临床症状以膝关节局部疼痛肿胀、活动受限为主［2］，晚期可出现关节畸形，对患者躯体、心理、社会等方面的功能及物质生活状态造成明显负面影响［3］，故在疾病早期积极采取保守治疗措施，延缓关节退变为佳。火针又名“淬刺”“烧针”，是针灸疗法中的一种，有研究［4，5］表明，火针在缓解疼痛、提高关节功能、消除患者负面心理、优化生活质量等方面效果均优于普通毫针刺法，且疗效持续时间更长［6］，安全性良好［7］，但其具体的起效机制仍未完全明确，还在进一步探索中。

丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）在生物体信号传导过程中扮演着重要角色，诸多研究表明MAPK 的4 个亚族之一的p38 与KOA的发生密切相关［8］，而肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为病程中最重要的炎症介质之一，能与多条信号通路协同作用，促使软骨基质降解，加重关节软骨破坏［9］。目前基于MAPK 信号转导通路研究火针干预KOA 的作用机制及靶点的报道相对匮乏。故本研究基于MAPK 信号通路，观察火针干预内膝眼、犊鼻穴对KOA 模型大鼠血清TNF-α 及软骨组织内p38 mRNA 的影响，进一步探讨火针治疗KOA 的作用机制，以期为临床中使用火针治疗KOA提供实验和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组8 周龄SPF 级雄性SD 大鼠15 只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0008。分笼饲养，每笼5 只，进食饮水不做限制。适应性喂养1 周后，抽签法将大鼠随机分为空白组、模型组与火针组，每组5只。

1.2 主要试剂与仪器木瓜蛋白酶，来自上海麦克林生化科技有限公司；大鼠TNF-α ELISA 检测试剂盒，来自上海酶联生物科技有限公司；TransZol Up，TransScript®All-in-One First-Strand cDNA Synhesis SuperMix for qPCR，PerfectStart®Green qPCR SuperMix（+Dye II）均由北京全式金有限公司提供；qPCR 引物，委托福州尚亚生物技术有限公司合成。多功能酶标分析仪（Infinite 200Pro），来自瑞士Tecan；全自动酶标洗板机（PW-812），深圳汇松科技发展有限公司；高速低温离心机（Centrifuge 5424R），来自Eppendorf中国有限公司；微量紫外-可见光分光光度计（NanoDrop™ One）、荧光定量PCR 仪（ABI QuantStudio 3），来自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 造模方法采用木瓜蛋白酶法建立膝骨性关节炎大鼠模型［10］，于适应性喂养后的第1、4、7天用异氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，R510-22-10）麻醉动物后，向模型组与火针组大鼠双侧膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶0.2 mL。最后1次造模结束后正常饲养2周，造模大鼠出现精神萎靡，活动量、食量明显降低，与空白组对比膝关节出现肿胀、骨性标志变浅且对局部疼痛刺激有明显反应等症状提示造模成功。

1.3.2 干预方法黑袜套住大鼠头部及躯干，仰卧位固定于自制大鼠固定板，使双后肢呈自然屈曲状态。火针组采用针灸针（厂家：苏州医疗用品厂有限公司，苏械注准20162200970，规格：0.25 mm×13 mm）点刺，取双侧内膝眼、犊鼻穴，穴位定位参考《实验针灸学》［11］，穴位局部以碘伏消毒并起定位作用，将针身前1/3 于酒精灯上烧至发白后迅速点刺穴位，深度约2 mm，疾进疾出，出针后按压针孔片刻。隔日干预1 次，共治疗2 周。空白组与模型组于干预日同方法抓取固定。

1.4 取材及指标检测

1.4.1 取材方法（1）麻醉：用异氟烷麻醉动物。（2）腹主动脉采血：确定大鼠被彻底麻醉后，将其置于操作台，腹部朝上，用手术剪打开腹腔，无菌纱布拨开内脏，见腹主动脉充分显露后，左手托起大鼠背部使其微微后仰，右手进行采血操作，收集动脉血约5 mL，室温静置1 h，离心机预冷至4℃后放入各样品，离心15 min（转速：3500 r/min，离心半径：65.5 mm），取上清液，分装后-80℃保存。（3）取膝关节软骨组织：逐层剥离大鼠后肢皮肤、肌肉、韧带等组织，打开大鼠右侧膝关节，手术刀刮取胫骨平台与股骨髁软骨组织碎片至EP管，置于液氮中备用。

1.4.2 指标检测方法（1）ELISA 法检测大鼠血清TNF-α 含量：取出低温保存的血清样品，室温自然化冻后再次离心，充分混匀各试剂，按大鼠TNF-α 酶联免疫吸附检测试剂盒说明书操作。（2）qPCR 法检测大鼠膝关节软骨组织内p38 mRNA 表达：软骨组织液氮研磨，提取总RNA、配制反转录总反应体系及qPCR 反应体系均严格按相关试剂盒说明书进行；反转录反应条件为42 ℃孵育15 min、85℃灭活5 s，产物cDNA 用于后续p38 qPCR 反应，于ABI QuantStudio 3 荧光定量PCR 仪上进行，反应程序设定为94 ℃ 30 s 后接94 ℃ 5 s、60 ℃30 s 循环40 次。以GAPDH 为内部参照，上游引物为5'ACGGCAAGTTCAACGGCACAG 3'，下 游 引 物 为5'GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC 3'；大鼠p38 上游引物为5' TGTGATTGGTCTGTTGGATGT 3'，下游引物为5'GGATTATGTCAGCCGAGTGTAT 3'。p38 mRNA 相对表达量以2-ΔΔCt法计算。

1.4.3 统计学方法数据分析处理用SPSS 23.0 软件进行。计量资料若符合正态分布且通过方差齐性检验，选用单因素方差分析，LSD 法进行组间比较；若符合正态分布但未通过方差齐性检验，则选用Games-Howell 法进行组间比较，均用（±s）描述。不符合正态分布的计量资料采用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠血清TNF-α含量比较造模4 周后，模型组大鼠血清TNF-α 水平明显高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；火针组经疗程干预，大鼠血清TNFα 含量已接近空白组水平（P＞0.05），与模型组对比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 3组大鼠血清TNF-α比较 （± s，pg/mL）

表1 3组大鼠血清TNF-α比较 （± s，pg/mL）

注：与模型组比较，1）P＜0.01；与空白组比较，2）P＞0.05。

TNF-α 248.21±5.051）285.60±5.31 249.99±8.021）2）组别空白组模型组火针组鼠数555

2.2 3组大鼠软骨组织p38 mRNA相对表达量比较模型组膝关节软骨组织内的p38 mRNA相对表达量相较于空白组有所增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），火针组膝关节软骨组织内p38 mRNA相对表达量与模型组相比明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 3组大鼠膝关节软骨组织p38 mRNA相对表达量比较（± s）

表2 3组大鼠膝关节软骨组织p38 mRNA相对表达量比较（± s）

注：与模型组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01。

p38 mRNA 3.83±1.121）6.99±1.06 2.22±0.472）组别空白组模型组火针组鼠数555

3 讨论

3.1 干预方法与选穴依据KOA临床症状可与中医学中有关“痹证”的描述相对应，初起以实证多见，多为风寒湿等外邪阻塞肢体经络所致［12］，治法以祛风散寒除湿、疏通经络、活血化瘀为主，兼以培补肝肾、扶助正气。火针针身经火焰烧灼后迅速刺入患处，带火热之性直达病灶，具有温阳补虚、温经散寒的功效，与普通针刺或温针灸相比，刺激量更大，疏通气血的效用更为强劲，又无灸法带来的艾烟困扰，且点刺操作疾进疾出、无需留针、简便效廉，亦方便了患者。“腧穴所在，主治所在”，复杂网络分析［13］表明针灸治疗KOA以下肢局部取穴为主，内膝眼与犊鼻穴位于髌韧带两侧凹陷处，使用频率在临床治疗KOA 的腧穴中排名前二；古籍中亦有内膝眼、犊鼻穴直接治疗膝痛的记载，如《玉龙歌》“膝头红肿不能行，必针膝眼膝关穴”，《灵枢·本输》曰：“刺犊鼻者，屈不能伸”，可见内膝眼、犊鼻穴能有效发挥近治作用，缓解膝关节疼痛、僵硬、屈伸不利等症状。

3.2 火针对TNF-α与p38 mRNA的影响TNF-α是一种多效性细胞因子，具有很强的促炎和免疫调节特性，在众多急慢性炎症性疾病中起关键作用［14］，被视为骨性关节炎的起始因子。刘军等［15］采用TNF-α 干预建立大鼠KOA 模型，与手术建模组进行对比，4 周后发现TNF-α对软骨细胞的影响与手术造模组相似，TNF-α 同样可促使炎症因子指标、软骨细胞凋亡率增高；Ozler 等［16］比较了2 个不同阶段的KOA 患者血清和滑液中基质金属蛋白酶-13（MMP-13）和TNF-α的水平，研究表明与KOA 3级的患者相比，KOA 4级的患者血清TNF-α表达进一步增加，TNF-α 水平系统性升高与骨关节炎分级严重程度一致。而现代研究［17，18］证实TNF-α与p38 MAPK通路有所关联。MAPK通路包括MAPK激酶的激酶、MAPK激酶和MAPK，呈三级激酶模式，受外界刺激信号影响，激酶逐级激活，共同调节细胞增殖、分化、应激适应、炎症反应等多个生理过程［19］，在关节软骨退变过程中可能处于枢纽位置，与关节软骨基质金属蛋白酶（MMPs）的合成，关节软骨炎性因子的产生，软骨细胞表型的保持、分化及软骨细胞的凋亡等有紧密联系［20］。而一些干预方法确实可以通过抑制p38的表达阻断p38 MAPK信号通路的异常激活，减轻KOA的炎症反应、减少软骨细胞凋亡、减缓软骨退行性改变进程［21］。

本实验结果表明运用木瓜蛋白酶法建立KOA 模型后，大鼠血清TNF-α 含量与膝关节软骨组织内p38 mRNA 的表达均上升明显，提示KOA 发生后，p38 MAPK 信号通路被激活，促使炎性因子分泌，推动KOA病程发展；但经过火针点刺内膝眼、犊鼻穴的KOA 模型大鼠血清TNF-α 及膝关节软骨组织内p38 mRNA 表达均下调，说明火针能够有效降低外周血内TNF-α 水平及软骨组织内p38的基因表达。

综上，减少免疫炎性因子含量、抑制p38 MAPK 信号通路活化可能是火针改善KOA临床症状的机制之一。