十全育真汤对早期活动性强直性脊柱炎患者外周血Th17/Treg细胞平衡的影响

吴琪 秦桂福 郑毅 宋玉

【摘 要】目的：觀察十全育真汤对早期活动性强直性脊柱炎患者疾病活动指标、Th17/Treg相关细胞因子、Th17/Treg细胞百分比，及相关基因RORC、FoxP3 mRNA表达的影响，初步从分子水平探讨十全育真汤治疗强直性脊柱炎的机制。方法：将60例强直性脊柱炎患者采用随机数字表法分为治疗组和对照组，每组30例。治疗组给予十全育真汤治疗，对照组给予柳氮磺吡啶肠溶片治疗。对2组患者治疗前后疾病活动指标、Th17/Treg相关细胞因子水平、Th17及Treg亚群占CD4+T细胞百分比、RORC和

FoxP3mRNA基因表达进行统计分析。结果：治疗后，2组视觉模拟评分法（VAS）评分、Bath强直性脊柱炎活动指数（BASDAI）、Bath强直性脊柱炎功能指数（BASFI）、Bath强直性脊柱炎总体指数（BAS-G）、红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6、IL-8、IL-17均明显降低，转化生长因子-β（TGF-β）、IL-10水平均显著升高（P < 0.05或

P < 0.01）；除BASDAI外，治疗组上述指标均优于对照组（P < 0.05或P < 0.01）。治疗后，2组Th17亚群

CD4+CD45RO+CCR6+细胞百分比均明显降低，治疗组Treg亚群CD4+CD25+FoxP3+细胞百分比明显升高

（P < 0.05或P < 0.01）；且治疗组均优于对照组（P < 0.05或P < 0.01）。治疗后，2组RORC mRNA表达

显著下降，FoxP3 mRNA表达显著升高（P < 0.05或P < 0.01）；且治疗组优于对照组（P < 0.05或P < 0.01）。结论：十全育真汤可显著控制早期活动性强直性脊柱炎炎症，减轻临床症状，其机制可能与抑制促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17）表达，促进抑炎因子（TGF-β、IL-10）释放，通过抑制RORC基因表达，促进FoxP3基因表达，调整Th17/Treg细胞数量，纠正Th17/Treg免疫失衡有关。

【关键词】 强直性脊柱炎；早期；活动性；十全育真汤；Th17/Treg细胞；免疫稳态调节

Effect of Shiquan Yuzhen Tang（十全育真汤）on Th17/Treg Cell Balance in Peripheral Blood of Patients with Early Active Ankylosing Spondylitis

WU Qi，QIN Gui-fu，ZHENG Yi，SONG Yu

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Shiquan Yuzhen Tang（十全育真汤）on disease

activity indicators，Th17/Treg related cytokines，Th17/Treg cell percentage，and expression of related genes RORC and FoxP3 mRNA in patients with early active ankylosing spondylitis，and preliminary explore the mechanism of Shiquan Yuzhen Tang in treating ankylosing spondylitis at the molecular level.Methods：Sixty patients

with ankylosing spondylitis were randomly divided into a treatment group and a control group，with

30 cases in each group.The treatment group was treated with Shiquan Yuzhen Tang，while the control group was treated with sulfasalazine enteric coated tablets.Statistical analysis was conducted on disease activity indicators，levels of Th17/Treg related cytokines，percentage of Th17

and Treg subsets in CD4+ T cells，and expre-

ssion of RORC and FoxP3 mRNA genes before and after treatment in both groups.Results：After treatment，VAS，BASDAI，BASFI，BAS-G，ESR，CRP，TNF- α，IL-6，IL-8，IL-17 were significantly reduced，and TGF-β and the levels of IL-10 significantly increased（P < 0.05 or P < 0.01）.Except BASDAI，the above indicators in the treatment group were better than those in the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.After treatment，the percentage of CD4+CD45RO+CCR6+ in the Th17 subgroup decreased significantly in both groups，while the percentage of CD4+CD25+FoxP3+ in the Treg subgroup increased significantly in the treatment group（P < 0.05

or P < 0.01）;and the treatment group was better than the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.After treatment，the expression of RORC mRNA decreased significantly in both groups，while the expression of FoxP3 mRNA increased significantly（P < 0.05 or P < 0.01）;and the treatment group was superior to the control group（P < 0.05 or P < 0.01）.Conclusion：Shiquan Yuzhen Tang can significantly control the inflammation of early active ankylosing spondylitis and alleviate clinical symptoms，and its mechanism may be related to the inhibition of inflammatory factors（TNF-α，IL-6，IL-8，IL-17）expression，promoting the release of anti-inflammatory factors TGF-β and IL-10，promoting FoxP3 gene expression by inhibiting RORC gene expression，adjusting Th17/Treg cell count，and correcting Th17/Treg immune imbalance.

【Keywords】 ankylosing spondylitis;early;activity;Shiquan Yuzhen Tang（十全育真湯）;Th17/Treg cells;

immune homeostasis regulation

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）好发于40岁以下青壮年男性，国内发病率为0.23%［1］。

由于本病早期临床症状及实验室检查缺乏特异性，晚期出现不可逆性脊柱融合僵直是青壮年致残的重要原因［2］，有报道提示早期干预是治疗AS的关

键［3-4］。目前，治疗目的不再是单纯地缓解症状，而是阻止疾病发展［5］。研究发现，辅助性T细胞17

（Th17）/调节性T细胞（Treg）比例失衡在AS发生、发展中起着关键作用，调整Th17细胞和Treg细胞亚群的免疫格局成为治疗AS的重要靶点［6］。

十全育真汤出自张锡纯《医学衷中参西录》，主治阴虚劳热，为气阴两伤兼血瘀型虚劳而设，“虚”与“瘀”为其主要病机。现代研究发现，十全育真汤具有抗肿瘤、抗衰老、调节免疫功能，清除氧自由基等作用［7-8］。本研究测定血清中Th17相关细胞因子含量，检测外周血Th17/Treg细胞表型比例，研究十全育真汤对RORC、FoxP3 mRNA表达的影响，探讨其对Th17/Treg免疫稳态的调控作用，为十全育真汤临床治疗AS提供理论依据。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2020年1月至2022年1月在湖北中医药大学附属医院就诊的早期活动性AS患者60例，采用随机数字表法分为治疗组和对照组，每组30例。治疗组男18例，女12例；年龄18～56岁，平均（37.85±8.36）岁；病程1～6年，平均（2.61±0.94）年。对照组男16例，女14例；年龄20～58岁，平均（39.43±6.52）岁；病程1～

8年，平均（3.42±0.63）年。2组患者在性别、年龄、病程等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经湖北中医药大学附属医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 诊断标准 按照1984年美国风湿病学会（ACR）修订的AS纽约标准［9］，活动期按照2009年国际脊柱关节炎协会ASDAS疾病活动度

标准［10］。

1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准；②入组前1周停用非甾体抗炎药、改善病情抗风湿药和生物制剂等；③患者自愿且签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①妊娠期、哺乳期妇女或有生育要求者；②疾病晚期脊柱强直、严重关节畸形者；③合并急性眼炎需用肾上腺皮质激素治疗者；④合并有心脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者。

2 方 法

2.1 治疗方法 治疗组给予十全育真汤，药物组成：野台参12 g、生黄芪12 g、生山药12 g、知母12 g、玄参12 g、生龙骨（捣细）12 g、生牡蛎（捣细）12 g、丹参6 g、三棱4.5 g、莪术4.5 g。煎液由湖北中医药大学附属医院药剂科提供。每日1剂，分早、晚温服。对照组给予柳氮磺吡啶肠溶片（上海信谊天平药业有限公司，批号309378，规格

0.25 g），每次1 g，每日2次，口服。2组均以

2周为1个疗程，连续治疗3个疗程。

2.2 AS疾病活动指标测定 观察治疗前后AS患者疾病活动指标，包括视觉模拟评分法（VAS）评分、Bath强直性脊柱炎活动指数（BASDAI）、Bath强直性脊柱炎功能指数（BASFI）、Bath强直性脊柱炎总体指数（BAS-G）、红细胞沉降率（ESR）和

C反应蛋白（CRP）。

2.3 ELISA法检测血清炎性细胞因子含量 研究对象清晨空腹采集外周静脉血4 mL，离心机以3000 r·min-1离心10 min，离心半径8 cm，收集培养上清，按照试剂盒说明书操作，最后用酶标仪450 nm测OD值，根据标准曲线计算上清液中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β、IL-10的含量。

2.4 流式细胞表面抗原检测 分离外周血单个核细胞（PBMCs），PBS洗涤后以2×106细胞浓度重悬，取100 mL细胞悬液，加入FITC标记的抗人CD4抗体、APC标记的抗人CCR6抗体、APC标记的抗人CD25抗体和PE标记CD45RO、FoxP3抗体，4 ℃共育30 min，用PBS洗去游离的抗体重悬，用流式细胞仪检测Th17

表型CD4+CD45RO+CCR6+和Treg表型CD4+CD25+

FoxP3+ T细胞的比例。

2.5 实时荧光定量PCR检测RORC、FoxP3 mRNA表达量 血液样本按1∶3加入红细胞裂解液，裂解后，按照Trizol法提取总RNA，逆转录成cDNA，反应条件：50 ℃逆转录15 min；

85 ℃灭活逆转录酶5 s；4 ℃保持10 min。将cDNA用无菌ddH2O做8倍稀释后进行PCR扩增，反应体系（20 μL）：cDNA 4 μL，正向引物

（10 μmmol·L-1）、反向引物（10 μmmol·L-1）各0.4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，H2O 4.8 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，

60 ℃退火延伸60 s，共循环40次。采用QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.1软件绘制溶解曲线，以GAPDH为内参，按2-ΔΔCt法计算RORC、FoxP3 mRNA的表达水平，并以正常对照组为标准计算相对表达量。引物序列及产物长度见表1。

2.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验，治疗前后比较采用配对t检验。以

P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 2组患者治疗前后疾病活动指标比较 治疗后，2组VAS评分、BASDAI、BASFI、BAS-G、ESR、CRP较治疗前均明显下降（P < 0.05或

P < 0.01）；且治疗组VAS评分、BASFI、BAS-G、

ESR、CRP降低较对照组更明显（P < 0.05或

P < 0.01）。见表2。

3.2 2组患者治疗前后Th17/Treg相关细胞因子水平比较 治疗后，2组TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17水平较治疗前明显降低，治疗组TGF-β、IL-10水平较治疗前明显升高（P < 0.05或P < 0.01）；且治疗组TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17、TGF-β、IL-10水平与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

3.3 2组患者治疗前后外周血Th17及Treg亚群占CD4+T细胞百分比比较 Th17检测方案包括FITC-CD4、PE-CD45RO、APC-CCR6，Treg检测方案包括FITC-CD4、APC-CD25、PE-FoxP3，利用FSC/SSC双参数散点图圈出淋巴细胞，设P1门。经过流式检测结果显示，与治疗前比较，对照组Th17亚群细胞百分比明显降低（P < 0.05），而对于Treg亚群的影响差异无统计学意义（P > 0.05）；治疗组Th17亚群细胞百分比明显降低，Treg亚群细胞百分比明显升高（P < 0.05或P < 0.01）。与对照组治疗后比较，治疗组Th17亚群细胞百分比降低更明显，Treg亚群细胞百分比升高更明顯（P < 0.05或P < 0.01）。见表4。

3.4 2组患者治疗前后Th17/Treg相关基因表达比较 治疗后，2组RORC mRNA表达明显降低，FoxP3 mRNA表达明显升高（P < 0.05或P < 0.01）；与对照组比较，治疗组RORC mRNA表达水平更低，FoxP3 mRNA表达水平更高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表5。

4 讨 论

Th17来源于初始CD4+T细胞的Th细胞亚群，可分泌多种炎性细胞因子，如IL-17、IL-6、IL-21、

TNF-α，广泛参与炎症反应，介导多种免疫性疾病及炎性疾病的持续和发展［11］。

Treg细胞是一类具有免疫调节功能的CD4+T细胞亚群，通过分泌TGF-β、IL-10加强免疫抑制因子表达，使致炎因子和免疫抗体分泌减少发挥免疫调节作用［12］。AS是一种慢性进行性炎性疾病，炎症是AS发展过程中的初始典型病理改变［13］。研究提示，AS的发生与免疫失调引起的促炎因子大量释放及抑制炎症因子释放不足有关［14］。研究证实，部分中药及中药复方可通过调节免疫细胞功能网络平衡、干预炎症介质、影响免疫细胞分化、介导免疫应答过程等多环节发挥抗炎作用［15-16］。本研究结果显示，与本组治疗前比较，十全育真汤治疗后TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17明显降低，而TGF-β、IL-10明显升高，提示该方可能具有调节炎性细胞因子的作用。与柳氮磺吡啶肠溶片治疗后相比，十全育真汤治疗后降低VAS、BASFI、BAS-G、ESR、CRP、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17更明显，且能明显升高TGF-β、IL-10水平，提示十全育真汤可显著控制早期活动性AS炎症、减轻临床症状，在AS治疗中有一定潜力。

Th17细胞表型为CD4+CD45RO+CCR6+，初始CD4+T细胞被TCR信号活化，通过TGF-β和IL-6的诱导协同作用，驱动CD4+T细胞表面高表达IL-23R，趋化因子CCR6及特征性转录因子

RORC［17-18］。通过IL-23R信号通路激活STAT3，协同转录因子IRF4和BATF共同参与RORC基因表达。Treg免疫表型为CD4+CD25+FoxP3+，根据Treg的来源不同，主要为2种亚型：天然性T细胞（nTreg）和获得性T细胞（iTreg）。nTreg通过激活TCR/CD3复合物和CD28介导的共刺激信号在胸腺中发育成熟并释放，iTreg可通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β抑制免疫活

化［19-20］。研究表明，Th17/Treg细胞数量在AS患者外周血中与健康者有差别，AS患者存在Th17/Treg平衡失调，细胞格局向Th17偏移［21-22］。本研究结果显示，与柳氮磺吡啶肠溶片比较，十全育真汤降低Th17亚群细胞百分比更明显，且显著升高Treg亚群细胞百分比，提示十全育真汤可能通过增加Treg细胞数量并减少Th17数量，使Th17/Treg向Treg一侧漂移，纠正Treg/Th17失衡，达到调节AS免疫紊乱，恢复免疫功能平衡的作用；RORC mRNA表达水平更低，且FoxP3 mRNA表达水平更高，说明十全育真汤可通过抑制RORC基因表达，促进FoxP3基因表达，使Th17/Treg亚群细胞趋于平衡。

综上所述，十全育真汤可显著控制早期活动性AS炎症，减轻临床症状，在AS治疗中有一定潜力。其机制可能与抑制促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17）表达，促进抑炎因子（TGF-β、IL-10）

释放；通过抑制RORC基因表达，促进FoxP3基因表达，调整Th17/Treg细胞数量，纠正Th17/Treg免疫失衡有關。

参考文献

［1］ 田好超，李哲，张宏军.强直性脊柱炎患者生存质量影响因素的研究进展［J］.风湿病与关节炎，2019，8（7）：56-59.

［2］ 李虎，李儒军，陶可，等.过表达CKLF1基因对强直性脊柱炎滑膜成纤维细胞增殖及成骨转化影响的实验研究［J］.中国骨与关节杂志，2019，8（4）：307-315.

［3］ GLINTBORG B，OSTERGAARDM，KROGH NS，et al.

Predictors of treatment response and drug continuation in 842 patients with ankylosing spondylitis treated with anti-tumour necrosis factor;results from 8 years' surveillance in the Danish nationwide DANBIO registry［J］.Ann Rheum Dis，2010，69（11）：2002-2008.

［4］ ARENDS S，BROUWER E，VAN DER VEER E，et al.

Baseline predictors of response and discontinuation of tumor necrosis actor-alpha blocking therapy in ankylosing spondylitis：a prospective longitu-dinal observational cohort study［J］.Arthritis Res Ther，2011，13（3）：R94-R102.

［5］ 姜平，魏凯，金晔华，等.浅谈强直性脊柱炎相关生物制剂治疗进展［J］.风湿病与关节炎，2021，10（7）：60-66，69.

［6］ 朱元悦，孙柔，陈广洁.Th17细胞和Treg细胞比例失衡在AS发展中作用的研究进展［J］.现代免疫学，2016，36（1）：58-61.

［7］ 方妍妍，刘健，万磊，等.新风胶囊含药血清通过抑制VEGFA/SDF-1/CXCR4通路缓解强直性脊柱炎患者血小板活化的机制［J］.免疫学杂志，2019，35（8）：691-696.

［8］ 朱云超，詹光杰，袁德培，等．十全育真汤对衰老小鼠学习记忆的影响［J］.中国老年学，2017，37（5）：1054-1056.

［9］ VAN DER LINDEN S，VALKENBURG HA，CATS A.Evaluation of diagnostic criteria for ankylosing spondylitis.A proposal for modification of the New York criteria［J］.Arthritis Rheum，1984，27（4）：361-368.

［10］ 李义凯，朱洪民，陈焕亮，等.两种强直性脊柱炎临床诊断标准的比较［J］.中国康复医学杂志，2010，25（8）：733-743.

［11］ CHARLOTTE K，ANJA M，PAULA SW，et al.Prostaglandin receptor EP4 expression by Th17 cells is asso-ciated with high disease activity in ankylosing spond-

ylitis［J］.Arthritis Res Ther，2019，21（1）：1-13.

［12］ GOSCHL L，SCHEINECKER C，BONELLI M.Treg cells in autoimmunity：from identification to Treg-based therapies［J］.Semin Immunopathol，2019，41（3）：301-314.

［13］ 刘越，赵艳梅，夏群.强直性脊柱炎的诊断与治疗进展［J］.中国矫形外科杂志，2015，23（3）：235-238.

［14］ NEGAR V，SAEED A，AHMADREZA J，et al.Role of innate immune system in the pathogenesis of ankylosing spondylitis［J］.Biomed Pharmacother，2018，105（5）：130-143.

［15］ 黄牧华，魏颖，董竞成.Th17细胞及其相关细胞因子在中药干预炎症机制中的研究进展［J］．中国免疫学杂志，2019，35（8）：1007-1017.

［16］ 吴琪，吴倩，周晓红，等.丹皮酚对强直性脊柱炎模型小鼠Wnt和BMP/Smad信号转导通路的影响［J］.中国药房，2018，29（11）：1500-1504.

［17］ 周茂華，张敏，欧阳维富，等.正常人外周血Th17细胞的频率、表型及其功能特征［J］.实用医学杂志，2013，29（9）：1385-1387.

［18］ IVANOV II，MC KENZIE BS，ZHOU L，et al.The orphan nuclear receptor ROR gammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells［J］.Cell，2006，126（6）：1121-1133.

［19］ 林瀚青，陶磊，路丽明.CD4+调节性T细胞：功能异质性、分群与疾病［J］.现代免疫学，2022，42（2）：89-96.

［20］ ZHEN JH，ZHAO XM，CUI CW.Research progress of Th17/Treg cells and their transcription factors in autoimmune diseases［J］. Am J Chin Med，2019，47（4）：83-92.

［21］ XU Y，WANG DM，LIANG HS，et al.The role of Th17/Treg axis in the traditional chinese medicine intervention on immune-mediated inflammatory diseases：a systematic review［J］.Am J Chin Med，2020，48（3）：535-558.

［22］ 陈鹏，刘宏潇.Th17/IL-17炎症轴介导强直性脊柱炎炎症的机制研究［J］．现代中西医结合杂志，2015，24（7）：796-798.

收稿日期：2023-02-11；修回日期：2023-03-27