禽肉、禽蛋中硝基呋喃代谢物残留的UPLC-MS/MS 检测方法研究

田 蕴 陶 威 徐 伟 葛 敏 张竞男 张苏珍 贺 燕 王益军 徐颢玮

（1连云港市畜产品质量监督检验测试中心，江苏连云港 222001；2宿迁市农畜产品质量检测中心，江苏宿迁 223800）

硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，对大多数的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌及原虫等病原体均有杀灭作用[1]。主要作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用，在畜禽和水产养殖中主要用于细菌性传染病的治疗和预防[2]。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体具有毒性，存在致癌、致畸和致突变的风险[3]，日本、欧盟和美国分别在1977、1995 和2002 年全面禁止将硝基呋喃类药物用于食源性动物[4]。我国也先后发布相关公告，将硝基呋喃类药物列入禁用清单。2002 年4 月，农业部第193 号公告将硝基呋喃类呋喃唑酮、呋喃它酮及制剂列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》；2005 年10 月，农业部第560 号公告将呋喃妥因和呋喃西林及其盐、酯及制剂列入首批《兽药地方标准废止目录》中禁用兽药类别；2019年12 月，农业部第250 号公告将呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。

硝基呋喃类药物结构中含有5 元杂环，化学稳定性较差，原型药在生物体内代谢很快，但其代谢产物和蛋白质结合物比较稳定，所以通常以其代谢物为目标分析物来测定其含量。硝基呋喃代谢物的检测方法主要有胶体金免疫法、酶联免疫法（ELISA）、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等[5]。近年来，随着检测技术的发展，硝基呋喃类药物残留的高效液相色谱-串联质谱法检测方法不断得到优化[6-7]，因其快速、准确、灵敏度高等优点而得到了广泛的应用。由于鸡蛋中蛋白、脂肪含量非常高且基质复杂，关于禽蛋与禽肉同时检测硝基呋喃代谢物鲜有报道[8-9]。为此，本研究建立了同时检测禽肉、禽蛋中4 种硝基呋喃代谢物（分子结构见图1）残留的液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析法，以供参考。

图1 4种硝基呋喃代谢物分子结构

1 材料与方法

1.1 仪器

超高效液相色谱－串联质谱仪（Waters UPLCTQS Micro）；电子天平（赛多利斯CPA225D）；高速冷冻离心机（Sigma 3-30KS）；OasisHLB 固相萃取柱（Waters）等。

1.2 药品与试剂

硝基呋喃代谢物标准品：呋喃它酮纯度99.69%，呋喃西林纯度99.80%，呋喃妥因纯度99.38%，呋喃唑酮纯度99.32%。硝基呋喃代谢物内标标准品：呋喃它酮-D5纯度97.33%，呋喃西林-13C纯度99.20%，呋喃妥因-D6 纯度97.9%，呋喃唑酮-D4纯度99.32%。甲醇、乙腈（色谱纯，Supelco公司）；乙酸乙酯、盐酸、磷酸氢二钾、氢氧化钠、2-硝基苯甲醛（分析纯，国药集团）；甲酸（色谱纯，aladdin公司）。盐酸溶液，0.2 mol/L；磷酸氢二钾溶液，0.1 mol/L；氢氧化钠溶液，1.0 mol/L；衍生剂：0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛二甲亚砜溶液，现用现配。实验用水均为超纯水。

1.3 标准溶液

标准储备液1 000 µg/mL：准确称取各标准品适量，于10 mL 容量瓶中，分别用甲醇溶解配制成1 000 µg/mL单标储备液。混合标准溶液：分别移取1.00 mL 的各单标储备液至同一10 mL 容量瓶，甲醇稀释得100 µg/mL 的混合标准溶液，-18 ℃避光保存。混合标准工作液：临用前按上述方法稀释得1 µg/mL、100 ng/mL 的混合标准工作液。内标标准溶液配制方法同上。

1.4 样品前处理

1.4.1 衍生准确称取（2.00±0.02）g试样于50 mL离心管中，依次加入100 ng/mL混合内标溶液100µL、0.2 mol/L 盐酸溶液5 mL，再加入0.05 mol/L 衍生剂100 µL。涡旋混匀，37 ℃恒温烘箱中避光放置过夜（约16 h）。

1.4.2 净化衍生后取出离心管冷却至室温，加入1 mL 0.1 moL/L 磷酸氢二钾溶液，再用100 µL 的1.0 mol/L NaOH溶液调节pH为7.4±0.2。10 000 r/min离心10 min，上清液用Oasis® HLB 固相萃取柱净化。Oasis® HLB 固相萃取柱（Waters 公司，200 mg，6cc）分别用3.0 mL甲醇和3.0 mL水活化，所有样液全部过柱，保持2～3 mL/min流速，用5.0 mL超纯水淋洗固相萃取柱并吹干。加入5.0 mL 乙酸乙酯洗脱，洗脱液于40 ℃下氮吹至近干，残渣加入1 mL 20%甲醇水溶液溶解，过0.2 µm滤膜得待测液。

1.5 分析条件

①色谱条件：色谱柱Waters Acquity BEH-C18（2.1 mm×100.0 mm，1.7µm）；进样量4µL；柱温30 ℃；流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：甲醇；流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序见表1。②质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压0.6 kV；去溶剂气温度500 ℃；去溶剂气流速1 000 L/Hr。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 质谱条件（电喷雾离子源正离子扫描ESI+模式）

用100 ng/mL 的混合标准溶液，以10 µL/min 的流速，进行一级质谱扫描，获得合适的母离子条件[10]，再对母离子进行二级扫描，调节碰撞能量和锥孔电压，筛选信号最强和次强子离子信号分别作为定量离子和定性离子，得出多反应监测条件。离子对、锥孔电压、碰撞能量见表2。

表2 4种硝基呋喃代谢物及其同位素内标多反应监测条件

2.2 方法线性

精密量取适量硝基呋喃混合标准溶液和内标混合溶液于50 mL离心管中，按照样品同法处理，得浓度为0.5、1、2、5、10、20 ng/mL（内标物浓度为5 ng/mL）系列混合标准工作溶液，供液相色谱-串联质谱仪测定。以外标和内标特征离子峰面积比为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程及相关系数见表3。从表3可以看出，4中硝基呋喃浓度在0.5～20 ng/mL 呈现良好的线性关系，线性相关系数R2在0.999 11~0.999 54。

表3 4种硝基呋喃代谢物回归方程及相关系数

2.3 方法灵敏度

添加浓度为0.5 µg/kg时，测得S/N=10，得出4种硝基呋喃定量限为0.50 µg/kg。

2.4 回收率与精密度

采用标准添加法，做添加回收试验。称取禽肉、禽蛋的空白样品，制成0.5、5.0、10.0 µg/kg 3 个浓度的添加样品，每个样品添加5个平行样，按照上述方法进行前处理，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）。由表4可知，4种硝基呋喃回收率在禽肉中为90.0%～108.2%，RSD 2.0%～9.7%；禽蛋中为91.7%～108.7%，RSD在2.4%～9.8%。

表4 鸡肉、鸡蛋中硝基呋喃代谢物平均回收率和相对标准偏差

每个浓度样品重复测定3次，连续测定3 d，计算日内精密度和日间精密度，结果见表5。禽肉中4种硝基呋喃代谢物日内精密度为3.1%～9.8%，日间精密度为4.2%～9.5%；禽蛋中硝基呋喃代谢物日内精密度为3.2%～9.4%，日间精密度为3.0%～7.9%。5.0 µg/kg禽肉加标样品4种药物及内标特征离子质量色谱见图2。

表5 禽肉、禽蛋中硝基呋喃代谢物日内、日间精密度

图2 5.0 μg/kg禽肉加标样品4种药物及内标特征离子质量色谱

3 结论与讨论

3.1 衍生剂用量

衍生剂的用量对测定结果有一定的影响，若用量不足，则衍生反应不完全，实际测定值低于理论值；过量的衍生剂易产生结晶，影响谱图基线，从而影响结果的准确度。经试验证明，本方法衍生剂量100 µL 较为合适。

3.2 pH值

样品溶液的pH 对测定结果的影响较大，为提高硝基呋喃代谢物的衍生物提取和净化效率，需要确保pH 值为7.4±0.2，用pH 计测定样品pH 操作不便且耗时。经大量试验，确定了禽肉、禽蛋样品中调节pH 为7.4±0.2 时，所消耗1.0 moL/L 磷酸氢二钾和2.0 moL/L 氢氧化钠溶液的体积经验值分别为1 mL、100 µL，为批量检测节约了大量时间。

3.3 净化条件

为了降低基质效应，本研究用Oasis® HLB 固相萃取柱净化，用乙酸乙酯洗脱目标分析物，洗脱液经氮气吹干，20%甲醇水溶液复溶，获得了理想的净化效果和回收率。

3.4 分析条件

采用电喷雾离子源正离子扫描获取化合物母离子和子离子信息，确定最佳定量离子对和定性离子对。通过对离子源参数进行优化，获得了较好的响应值。

3.5 注意事项

硝基呋喃类代谢物见光易分解，所有操作尽可能避光操作，所用溶液用棕色瓶存放，样品经处理后尽快上机分析。

4 结论

当硝基呋喃代谢物浓度为1.0~10.0 µg/kg，禽肉中回收率为90.0%～108.2%，禽蛋中回收率为91.7%~108.7%，硝基呋喃代谢物检出限为0.50 µg/kg。本试验方法具有较好的准确度和重复性，操作简便，灵敏度高，准确性好，适合大批量禽肉、禽蛋产品中硝基呋喃代谢物残留的检测分析。