2 种委陵菜总黄酮提取工艺研究

于 波 徐昕萍 张 越 李一鸣 曹 燕 赵晓菊 张奕婷

（大庆师范学院生物工程学院，黑龙江大庆 163712）

光叉委陵菜（Potentilla bifurcavar.glabrata）和翻白委陵菜（Potentilla discolor）均为蔷薇科（Rosaceae）委陵菜属（Potentilla）多年生草本植物，耐盐、抗干旱能力较强[1-2]，多生于草甸沙地或山坡、林缘、灌丛等环境，分布于我国多个省市。翻白委陵菜具有消肿止血、清热解毒的功效，有较高的药用价值和经济价值[3]。研究发现，翻白委陵菜含有的黄酮类物质对治疗多种疾病均有较好的疗效[4-5]，具有降血糖、抗菌、抗氧化等功效[6-7]。目前，对光叉委陵菜的研究相对较少，为进一步促进委陵菜属植物的开发与利用，本试验对光叉委陵菜和翻白委陵菜中总黄酮提取工艺进行了研究，以期为委陵菜属植物的进一步综合利用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料及药品

试验所用的光叉委陵菜和翻白委陵菜于2022年7 月采自大庆师范学院校园内，取其地上部分清洗干净，60 ℃烘干后粉碎研磨成粉状，过60目筛，过筛后的粉末盛于棕色广口瓶，备用。芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所，试验所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2 试验仪器

高速万能粉碎机（上海启前电子科技有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、超速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）、可见光分光光度计（上海精密仪器有限公司）、恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、超声波细胞破碎仪（宁波新艺超声设备有限公司）、微波炉（广东格兰仕微波炉电器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 总黄酮提取流程称取委陵菜粉末置于100 mL锥形瓶中，按料液比1∶40（g/mL）加入40%乙醇溶剂，置室温浸泡12 h，超声震荡12 min后转入微波炉高火20 s，70 ℃恒温水浴浸提2 h，冷却至室温，4 000 r/min 离心去除沉淀，上清液使用无水乙醇定容至100 mL作为提取样品。

1.3.2 标准曲线绘制参照郑明兰[8]的方法，稍作改动。称取芦丁标准样品5 mg，用无水乙醇溶解并定容至50 mL，制得0.1 mg/mL芦丁标准品母液。分别吸取芦丁标准品母液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 mL至25 mL比色管内，分别加入5% NaNO2试液1.0 mL，摇匀静置6 min，再加10% AlCl3试液1.0 mL，摇匀静置6 min，最后加入1 mol/L NaOH 溶液10 mL，用超纯水定容。以蒸馏水代替芦丁标准品母液作为空白对照，测定比色管内溶液500 nm 处的吸光光度值，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光光度值为纵坐标绘制出芦丁标准曲线（图1），通过Origin软件计算得到回归方程为Y=0.309 86X+0.017 22，R2=0.992 88，芦丁浓度在0.10~0.65 mg/mL时线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线

1.3.3 总黄酮提取率计算吸取待测样品1 mL于25 mL 比色管内，按1.3.2 方法测定其吸光光度值，根据回归方程计算出样品的总黄酮浓度，计算获得总黄酮提取率。总黄酮提取率计算公式如下：

式中，Φ为委陵菜中总黄酮提取率，%；C为样品中总黄酮浓度，mg/mL；V为无水乙醇定容的样品体积，mL；M为委陵菜样品质量，mg。

1.4 单因素试验

分别考察浸提温度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）、浸提时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、超声时间（3、6、9、12、15、18、21 min）、微波时间（5、10、15、20、25、30、35 s）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45）和乙醇浓度（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）6 个因素对总黄酮提取率的影响。

1.5 正交试验

根据上述单因素试验结果，每个因素取3 个水平，采用7因素3水平L18（37）正交表进行正交试验，以获得光叉委陵菜和翻白委陵菜较优的总黄酮提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素对2种委陵菜总黄酮提取率的影响

2.1.1 浸提温度如图2所示，2种委陵菜总黄酮提取率随着浸提温度的升高逐渐升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分别在浸提温度为50、60 ℃时，总黄酮提取率最高，达到峰值后，提取率逐渐降低。

图2 浸提温度对2种委陵菜总黄酮提取率的影响

2.1.2 浸提时间如图3所示，2种委陵菜总黄酮提取率随着浸提时间的增加逐渐升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分别在浸提时间为1.5、2.0 h 时，总黄酮提取率最高，达到峰值后，提取率逐渐降低，2.5 h后下降趋势比较平缓。

图3 浸提时间对2种委陵菜总黄酮提取率的影响

2.1.3 超声时间如图4 所示，光叉委陵菜在超声时间为9 min 时，总黄酮提取率达到峰值，随后总黄酮提取率下降；翻白委陵菜在超声时间为18 min时，总黄酮提取率达到峰值。

图4 超声时间对2种委陵菜总黄酮提取率的影响

2.1.4 微波时间如图5 所示，2 种委陵菜总黄酮提取率随微波时间的增加逐渐升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分别在微波时间为15、25 s 时，总黄酮提取率达到峰值，随后呈下降趋势。

图5 微波时间对2 种委陵菜总黄酮提取率的影响

2.1.5 料液比如图6 所示，2 种委陵菜总黄酮提取率随料液比增加的变化趋势一致，光叉委陵菜总黄酮提取率高于翻白委陵菜，在料液比为1∶35 时，2 种委陵菜总黄酮提取率达到峰值。

图6 料液比对2种委陵菜总黄酮提取率的影响

2.1.6 乙醇浓度如图7 所示，2 种委陵菜总黄酮提取率随乙醇浓度的增加逐渐升高，光叉委陵菜和翻白委陵菜分别在乙醇浓度为70%、60%时，总黄酮提取率达到峰值，随后呈下降趋势。

图7 乙醇浓度对2种委陵菜总黄酮提取率的影响

2.2 正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，选取浸提温度、浸提时间、超声时间、微波时间、料液比、乙醇浓度6 个因素，每个因素取3水平作正交试验（表1、表2）。以总黄酮提取率为指标，按照L18（37）正交设计进行试验，确定最佳提取条件，试验结果见表3~6。

表1 光叉委陵菜正交设计因素与水平

表2 翻白委陵菜正交设计因素与水平

表3 光叉委陵菜总黄酮提取正交试验结果

由表3 得出，各因素对光叉委陵菜总黄酮提取率的影响程度依次为F>A>C>B>E>D。由表4 得出，F、A、C 3个因素影响显著，B、E、D 3个因素影响不显著。最佳的提取工艺条件为A3B2C2D2E2F2，即浸提温度60 ℃、浸提时间1.5 h、超声时间9 min、微波时间15 s、料液比1∶35（g/mL）、乙醇浓度70%。

表4 光叉委陵菜总黄酮提取正交试验方差分析

由表5 得出，各因素对翻白委陵菜总黄酮提取率的影响程度依次为F>B>A>D>C>E。由表6得出，F 因素影响显著，其余因素影响不显著。最佳的提取工艺条件为A1B2C1D2E2F3，即浸提温度50 ℃、浸提时间2 h、超声时间15 min、微波时间20 s、料液比1∶35（g/mL）、乙醇浓度70%。

表5 翻白委陵菜总黄酮提取正交试验结果

表6 翻白委陵菜总黄酮提取正交试验方差分析

2.3 验证性试验

为了验证光叉委陵菜和翻白委陵菜总黄酮的最佳提取工艺，测定2 种委陵菜的总黄酮提取率，结果表明最佳提取工艺条件下，光叉委陵菜的总黄酮提取率为4.92%、翻白委陵菜的总黄酮提取率为3.81%，与正交试验结果相近。

3 结论

以光叉委陵菜和翻白委陵菜为材料，采用单因素和正交试验法优化了2种委陵菜总黄酮的提取工艺，得到光叉委陵菜总黄酮的最佳提取工艺条件为浸提温度60 ℃、浸提时间1.5 h、超声时间9 min、微波时间15 s，料液比1∶35（g/mL）、乙醇浓度70%；翻白委陵菜总黄酮的最佳提取工艺条件为浸提温度50 ℃、浸提时间2 h、超声时间15 min、微波时间20 s、料液比1∶35（g/mL）、乙醇浓度70%。在最佳提取工艺条件下，光叉委陵菜和翻白委陵菜总黄酮提取率分别为4.92%、3.81%，光叉委陵菜中黄酮类成分更为丰富，具有良好的药用开发价值。