基于网络药理学和实验验证的甘麦大枣汤抗抑郁的物质基础及作用机制研究*

蒲莲莲，刘漫，杨颖，嵇晶，何苗，程建明，刘陶世

1 南京中医药大学药学院 江苏南京 210023

2 江苏省经典名方工程研究中心 江苏南京 210023

3 太极四川绵阳制药有限公司 四川绵阳 621000

甘麦大枣汤为“医圣”张仲景所创，载于《金匮要略》[1]曰：“妇人脏躁，喜悲伤欲哭……甘麦大枣汤主之。甘草三两，小麦一斤，大枣十枚……亦补脾气。”该方组成简单，仅有甘草、小麦、大枣三味，可谓药简效彰。方中小麦补营益阴，宁心安神为君药；甘草补养心气，和中缓急为臣药；大枣补中益气，养血安神为佐使药；三物合用，共奏甘润滋养，养心宁神，和中缓急之功[2]。历来医家常用于脏躁、郁症等情志类疾病。有统计[3]分析古籍中治疗类似抑郁症的方剂中，该方使用频数占其汇总方剂的榜首。现代临床常用于各类抑郁症、失眠、更年期综合征等的治疗[4-6]。甘麦大枣汤的长期临床应用已证明其疗效确切，但对其研究多集中于药理作用、临床疗效等方面，缺乏对其复方中化学成分的系统分析，严重限制了该方药效物质基础研究及质量控制指标的确定。

UPLC-Q-TOF-MS是一种高通量、高灵敏度、快速高效的非靶向分析方法，广泛应用于单味或复方中药化学成分的系统分析。网络药理学是一种基于系统生物学理论，选取特定信号节点（Nodes）进行多靶点药物分子设计的方法。应用于中药研究，形象的反应了中药发挥疗效的多成分、多靶点、多途径的特点。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技术结合网络药理学及动物实验，探讨甘麦大枣汤抗抑郁的关键成分及作用机制。

材 料

1 仪器

LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津）；Triple Tof5600 +质谱仪（美国ABSCIEX）；超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；电热套（巩义市予华仪器有限责任公司）；电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

2 药材和试剂

方中甘草、淮小麦、大枣三味，均购置于安徽亳州中药材市场，经鉴定甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根和根茎；淮小麦为禾本科植物小麦Triticum aestivum L.的颖果；大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的果实。

甘草酸铵对照品（中检所，110731-202021）；甘草苷对照品（批号111610-201908，99%）；熊果酸对照品（批号L03A6Y1，99%）；齐墩果酸对照品（批号H04J9262784，99%）；盐酸氟西汀（上海中西制药有限公司）；LPS（Biosharp公司）；甲醇（美国TEDIA公司）；乙醇（无锡市亚盛化工有限公司）；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）；乙腈（德国默克公司）；甲酸（阿拉丁试剂（上海）有限公司）；小鼠ELISA试剂盒（南京翼飞雪生物科技有限公司）。

3 实验动物

Babl/c雄性小鼠50只，体质量18～20 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号SCXK（沪）2022-0004。适应性喂养7 d，自由饮食和饮水。南京中医药大学实验动物伦理委员会审查并批准（202207A062）。

方 法

1 色谱条件

色谱柱：Kromasil （250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温：40 ℃，流动相A为0.1%甲酸水（v/v），流动相B为乙腈。梯度洗脱：0～3 min，10% B；3～39 min，90%B；39～41 min，90% B；41～42 min，10% B；42～45 min，0 B。流速为1mL/min，进样量为20 μL。

2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），离子源温度（TEM）550 ℃，气帘气（CUR）40 psi，雾化气（GSI）55 psi，辅助加热气（GS2）55 psi，离子源喷雾电压（IS）5500 V/-5500 V，碰撞电压（CE）10V/-10V，去簇电压（DP）100 V/-100V，扫描范围为m/z 50～1500。

3 供试品溶液制备

3.1 对照品溶液 分别取甘草酸铵、甘草苷、熊果酸、齐墩果酸对照品各10 mg，置10 mL容量瓶中，甲醇超声溶解，定容，制成1mg/mL的对照品溶液。分别量取各对照品溶液液适量，混合后加入甲醇稀释，备用。

3.2 甘麦大枣汤样品溶液 取甘草9 g、淮小麦30 g、大枣15 g，10倍量水浸泡30 min，加热至沸腾后煎煮60 min，过滤，再加8倍量水煎煮50 min，滤过，取滤液8000 r.min-1离心10 min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，备用。取上述所得甘麦大枣汤滤液，浓缩至生药量1g/m L。

3.3 甘麦大枣汤总黄酮溶液 取甘草9 g、淮小麦30 g、大枣15 g，10倍量乙醇浸泡30 min，回流提取60 min，滤过，浓缩至无醇味，加水稀释至生药量1 g/m L。

3.4 盐酸氟西汀溶液 取适量药品，以生理盐水配制为2mg/mL药物溶液。

4 化合物结构分析

照“1”“2”项下条件，采集甘麦大枣汤正、负离子模式下的质谱数据。首先，通过SciFinder、本草组鉴（HERB）以及文献，收集整理甘草、淮小麦、大枣的化学成分信息，构建甘麦大枣汤化学成分数据库。其次，采用Peakview 1.2软件对一级质谱提供的精确准分子离子峰进行分析，计算其未知化合物的元素组成和可能的分子式（误差±5.0×10-6），对各色谱峰进行初步鉴定。最后，将目标化合物的二级质谱碎片信息与对照品、数据库及文献提供的保留时间、裂解规律等进行对比分析。

5 网络药理学分析

5.1 甘麦大枣汤潜在活性成分 通过PubChem数据库获取已鉴定各成分的SMILES号或2D结构，导入SwissADME数据库，根据ADME参数筛选潜在活性化学成分。筛选条件GI absorption为High，Lipinski为Yes[7-8]，少数不符合条件者，但有研究证明其为主要有效成分，亦将其作为潜在活性成分。如甘草苷、甘草酸[9-10]。

5.2 甘麦大枣汤潜在作用靶点 将潜在活性成分导入SuperPred和SwissTargetPrediction 数据库，预测其靶点，整合去重。在GeneCards、DrugBank、PharmGKB、TDD数据库，以“depression”为关键词检索，整合去重得到抑郁症疾病靶点。分别将成分和疾病靶点输入Venny 2.1网站，绘制Venn图，获取交集靶点，即为潜在作用靶点。

5.3 成分—靶点网络构建 将活性成分、疾病及靶点输入Cytoscape 3.9.1软件，构建成分-疾病-靶点网络。通过CytoNCA插件对网络进行拓扑分析，根据degree大小筛选甘麦大枣汤抗抑郁的关键成分。

5.4 PPI网络构建 将潜在作用靶点输入String11.5数据库，物种选择“Homo sapiens”，其他参数默认不变，获取PPI网络。将结果导入Cytoscape 3.9.1软件，绘制PPI网络图，利用其CytoNCA功能对PPI网络信息进行拓扑分析，得到甘麦大枣汤治疗抑郁症的核心靶点。

5.5 GO功能与 KEGG 通路富集分析 将筛选出的交集靶点输入Metascape数据库，以P＜0.01 作为条件，进行GO功能与 KEGG通路富集分析，并采用“微生信”云平台进行数据可视化。最终，构建甘麦大枣汤抗抑郁作用的“成分-靶点-通路”关联网络。

6 动物实验

6.1 分组及给药 小鼠适应性喂养7天后，按体重随机分为空白组、模型组、盐酸氟西汀组、甘麦大枣汤组、甘麦大枣汤总黄酮组，每组8只小鼠。各组小鼠均灌胃给药，2次/d（隔12 h）连续给药7d。空白组、模型组灌胃纯水，其他组灌胃各组对应药物。灌胃体积均为10 mL/kg。

6.2 急性抑郁造模方法 在实验第8天，以LPS腹腔注射方式造模。除空白组外，各组小鼠腹腔注射LPS溶液（.83 mg/kg），给药体积10 mL/kg，空白组注射等体积生理盐水。4.5 h后开始行为学检测，评价小鼠抑郁症状。造模6 h后收集小鼠外周血清及脑组织，分别于-20℃及-80℃保存待测。

6.3 行为学检测方法

6.3.1 悬尾实验 在小鼠尾尖约2cm处固定，将小鼠头朝下悬挂于一四周封闭纸箱内6min，距离底部约10cm，记录小鼠2～6min内的累计不动时间。

6.3.2 强迫游泳实验 将小鼠置于一直径10cm，水深20cm容器内，水温24℃左右，观察6min内小鼠游泳情况，记录小鼠2～6min内的累计不动时间。

6.4 小鼠外周血清IL-1β、TNF-α、5-HT、NE含量检测 各组小鼠血清均采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β、NE、5-HT的含量，实验步骤按试剂盒方法操作。

结 果

1 甘麦大枣汤化学成分的鉴定

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术以质谱条件项下质谱条件对甘麦大枣汤样品进行正、负离子全扫，其总离子流图见图1。照化合物结构分析项下数据处理方法，在甘麦大枣汤中共鉴定出95个化合物，包括45个黄酮类、19个萜类、12个有机酸类、4个氨基酸类以及15个其他类化合物。各化合物的保留时间（tR）、碎片离子等信息，见表1。

表1 甘麦大枣汤化学成分鉴定分析

图1 甘麦大枣汤的负离子（A）和正离子（B）模式下 TIC 图

2 网络药理学分析

2.1 甘麦大枣汤化学成分及其潜在作用靶点 共筛选获得59个活性成分，对活性成分别进行靶点的预测和收集，获得成分靶点366个和602个，整理去重共得成分靶点155个。以“depression”为关键词，进行数据库检索，合并去重，最终得到1037个疾病靶点。绘制成分和疾病靶点Venn图，获得潜在靶点40个，见图2。

图2 成分靶点与疾病靶点韦恩图

2.2 成分—靶点网络构建 将甘麦大枣汤活性成分、疾病及交集靶点输入Cytoscape 3.9.1 软件，构建甘麦大枣汤成分-靶点网络（图3）。通过拓扑分析，以degree计，大于中位数的即为甘麦大枣汤抗抑郁的关键成分，共12个，即芹菜素、N-去甲（基）荷叶碱、山奈酚、大豆素、柚皮素、甘草黄酮C、乌拉尔醇、甘草黄酮醇、甘草宁C、甘草次酸、乌药碱、巴婆碱。

图3 成分-靶点网络图

2.3 PPI网络的构建及核心靶点筛选 将潜在作用靶点导入String11.5数据库，获取靶点间相互作用关系，构建PPI网络，见图4。以degree、betweenness、closeness 3 个重要拓扑参数均大于其中位数进行筛选，并以degree计，TNF、SLC6A3、ESR1、MAOB、MAPK1、PTGS2、MAOA等16个靶点可能为甘麦大枣汤抗抑郁作用的核心靶点。

图4 交集靶点 PPI 网络图

2.4 GO功能KEGG信号通路分析 对个16核心靶点进行GO功能和KEGG信号通路富集分析，共获得个GO条目284个，分别为生物过程（BP）条目248 个，细胞组成（CC）条目28 个，分子功能（MF）条目8 个，见图5。生物过程主要涉及到神经递质水平调节、跨突触信号调节、认知、学习和记忆等；细胞组成主要是树突、膜筏、轴突、突触膜等；分子功能主要包括胺结合、神经递质受体活性、蛋白酶结合、磷酸酶结合、氧化还原酶活性等。

图5 GO 富集分析

通过 KEGG 富集分析得到信号通路37条，取前20条通路进行可视化见图6。结果显示，与甘麦大枣汤抗抑郁有密切联系的信号通路主要有神经退行性病变-多种疾病通路）、5-羟色胺能突触、环磷酸腺苷信号传导、帕金森病、神经活性配体-受体相互作用等神经相关通路；乳腺癌、催乳素信号通路、内分泌抵抗、雌激素信号通路等内分泌相关通路；IL-17信号通路、人类乳突病毒感染、T细胞受体信号通路等炎症免疫相关通路。构建甘麦大枣汤抗抑郁作用的“关键活性成分-靶基因-信号通路”网络，见图7。

图7 成分-靶点-通路网络

3 动物实验

3.1 小鼠行为学检测结果 结果如表2所示，与空白组比较，模型组悬尾及强迫游泳累计不动时间均明显延长，表明造模成功。与模型组相比，各组悬尾及强迫游泳累计不动时间均显著降低。

表2 各组对LPS致急性抑郁小鼠抑郁样行为的影响（ ±s，n=8）

表2 各组对LPS致急性抑郁小鼠抑郁样行为的影响（ ±s，n=8）

注：与空白组比较 # P＜0.01，与模型组比较 * P＜0.01

组别剂量悬尾累计不动时间/s强迫游泳累计不动时间/s体重/g空白组—47.69±13.2385.77±17.7924.25±0.77模型组—86.13±16.95#141.11±16.75#24.26±1.58盐酸氟西汀组20mg/kg27.05±7.37*47.76±14.99*23.41±0.57甘麦大枣汤组10g/kg53.91±13.47*48.67±11.19*23.90±0.81甘麦大枣汤总黄酮组10g/kg49.45±12.22*55.90±12.51*24.03±1.37

3.2 小鼠外周血清IL-1β、TNF-α含量结果 结果如表3所示，与空白组比较，模型组小鼠外周血清中的 IL-1β、TNF-α含量均显著升高。与模型组相比，各给药组均可明显降低小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量，其中甘麦大枣汤组较其总黄酮组低，差异具有显著性。

表3 各组对LPS致急性抑郁小鼠炎性因子及神经递质的影响（ ±s，n=8）

表3 各组对LPS致急性抑郁小鼠炎性因子及神经递质的影响（ ±s，n=8）

注：与空白组比较 # P＜0.01，与模型组比较 * P＜0.01

组别剂量IL-1β/ng·L-1TNF-α/ng·L-1空白组—41.42±5.47188.01±65.19模型组—115.22±7.06#664.40±42.02#盐酸氟西汀组20mg/kg54.49±7.48*290.62±85.68*甘麦大枣汤组10g/kg62.98±3.12*324.76±58.45*甘麦大枣汤总黄酮组10g/kg74.40±3.82*412.23±42.45*

3.3 小鼠外周血清5-HT、NE含量结果 结果如表4所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织中的5-HT、NE含量明显降低。与模型组相比，各给药组5-HT、NE含量不同程度升高。甘麦大枣汤组较其总黄酮组高，差异具有显著性。

表4 各组对LPS致急性抑郁小鼠5-HT、NE的影响（ ±s，n=8）

表4 各组对LPS致急性抑郁小鼠5-HT、NE的影响（ ±s，n=8）

注：与空白组比较 # P＜0.01，与模型组比较 * P＜0.01

组别剂量5-HT/ng·L-1 NE/ng·L-1空白组—218.53±6.69121.60±10.91模型组—71.39±5.93#51.01±10.15#盐酸氟西汀组20mg/kg190.17±9.28*110.00±9.03*甘麦大枣汤组10g/kg161.81±11.40*97.16±6.27*甘麦大枣汤总黄酮组10g/kg133.64±9.03*84.23±4.16*

讨 论

本研究从甘麦大枣汤的水煎液中共鉴定出95个化学成分，包括黄酮类、萜类、有机酸等，经筛选获得59个活性成分。在此基础上，运用网络药理学分析预测了甘麦大枣汤抗抑郁作用的关键活性成分、核心靶点和作用机制。筛选出的芹菜素、N-去甲（基）荷叶碱、甘草黄酮C、甘草黄酮醇、甘草次酸等12个关键活性成分，其中8个为黄酮类成分。已有研究证实[32]，多种黄酮类化合物具有抗抑郁作用，其作用机制可能与透过血脑屏障作用于中枢神经系统，影响单胺神经递质、调节HPA轴相关。其中，芹菜素可调节大脑中的5-HT水平发挥抗抑郁作用。甘草黄酮能上调BDNF及其受体Trk B的蛋白表达发挥抗抑郁作用[33]。甘草次酸通过抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放产生抗抑郁作用[34]。因此，可认为黄酮类成分、甘草次酸可能是甘麦大枣汤抗抑郁作用的主要物质基础。此外，获得了TNF、SLC6A3、MAOB等16个核心靶点，其中TNF是一种促炎细胞因子，而抑郁症的发生、发展与促炎细胞因子的中枢和外周浓度升高密切相关[35]，机体应激后情绪、行为的改变也与炎性因子密切相关[36]。许一凡[37]等研究发现甘麦大枣汤能明显改善LPS急性抑郁模型小鼠抑郁样行为，显著降低外周及中枢IL-1β、TNF-α含量，抑制IL-1β基因表达。因此，可表明预测的潜在靶点TNF是甘麦大枣汤主要成分抗抑郁的靶点。DA、5-HT、NE等单胺类神经递质异常主流认为是抑郁发生的主要因素。SLC6A3是一种多巴胺转运蛋白，在神经递质调节方面起着重要作用，与多种精神类疾病发生相关[38]。MAOB（MAOA）是一种单胺氧化酶，与5-HT代谢密切相关[39]。因此，可从炎性因子、多巴胺、5-HT能神经系统调控等角度开展甘麦大枣汤抗抑郁的作用机制研究。

GO功能富集分析，甘麦大枣汤可通过神经递质水平调节、跨突触信号调节、认知、学习和记忆等BP；树突、膜筏、轴突、突触膜等CC；胺结合、神经递质受体活性、蛋白酶结合、磷酸酶结合等MF抗抑郁。KEGG通路富集分析了37条信号通路，包括神经退行性病变-多种疾病通路、5-羟色胺能突触、阿兹海默病等。其中5-羟色胺能突触通过调控相关5-HT的水平及相应受体数量或功能改善抑郁症状[40]，也可影响γ-氨基丁酸、多巴胺等其他神经递质释放，还可以调控HPA轴发挥抗抑郁作用[41]。神经退行性病变-多种疾病通路与阿尔茨海默、帕金森、脑萎缩等各种神经损害性疾病密切相关，表现为大脑或脊髓特定区域神经元死亡[42]。有研究[43]表明神经退行性疾病和抑郁症状有一定的关联度，两者之间拥有共同的发病机制或病理生理学变化，神经退行性疾病可能直接参与抑郁症的发生发展。

LPS腹腔注射建立急性抑郁动物模型，已广泛应用于研究药物抗抑郁作用与抑制炎症反应关系的模型载体[44-45]。本研究动物实验结果显示，经LPS应激后，与空白组比较，模型组小鼠强迫游泳和悬尾不动时间均显著增加，表明LPS可诱导小鼠行为学异常，抑郁造模成功。与模型组相比，各给药组均可改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为，表现出抗抑郁作用，同时甘麦大枣汤及其总黄酮组可降低小鼠血清中IL-1β、TNF-α含量，上调5-HT、NE含量。该结果与网络药理学研究所预测的靶点TNF、MAOB、通路5-HT能突触及黄酮类成分相符，表明网络药理学结果具有一定的准确性。

综上所述，本研究首次采用液质联用技术结合网络药理学初步阐明了甘麦大枣汤中关键活性成分、潜在作用靶点及通路，并通过动物实验进行验证，表明甘麦大枣汤抗抑郁作用的发挥与下调IL-1β、TNF-α含量、上调5-HT、NE含量相关。为该方进一步的药效物质基础和作用机制研究提供了参考依据。