“知母-牡丹皮”治疗系统性红斑狼疮作用机制探讨*

胡赛赛，万磊，刘健，黄传兵，李方泽，陈莹莹，程静

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230031

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种较为复杂的自身免疫性疾病，可能会累及到身体的多个脏器和系统，常见的有肾脏、心脏、肺部、脑、皮肤和血液等[1]。目前较常见的治疗手段主要是糖皮质激素联合免疫抑制剂，近些年来生物制剂的应用也逐渐广泛起来[2]。目前患者的生存率已有大幅度的升高[3]，但SLE患者临床表现多样，部分病人无法耐受糖皮质激素的治疗，且其不良反应令人闻之色变，西医治疗目前可选择的药物还十分有限。SLE患者的临床表现差异明显，临床表现各异也是其漏诊率、误诊率高的一个原因，而这正与中医学所遵循的“辨证论治”相呼应。中医治疗可以根据病人相应的症状提供个体化的治疗方案，改善其症状，减轻西药的不良反应，协助减少西药用量等，最终达到提高生活质量的目的[4]。知母、牡丹皮在治疗SLE中应用广泛，但目前知母-牡丹皮治疗SLE尚缺乏依据合理解释其作用机制[5]，本文基于网络药理学及分子对接方法分析“知母-牡丹皮”治疗 SLE 的有效成分及目标靶点，以期更好的探讨知母-牡丹皮治疗SLE的作用机制。

资料与方法

1 知母-牡丹皮有效成分及靶点的筛选

使用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP，输入知母、牡丹皮为关键词进行检索，制定筛选标准：口服生物利用度（OB）≥30%、化合物类药性（DL）≥0.18，筛选出知母-牡丹皮的有效成分，并统计其相应的靶点。利用UniProt数据库将蛋白靶点转化为基因靶点，得到知母-牡丹皮有效成分及其相应靶点。

2 SLE疾病靶点的筛选

以“Systemic Lupus Erythematosus”为检索词在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank及DisGeNE数据库检索SLE的疾病靶点。

3 作“SLE—知母-牡丹皮”Venn图以及构建“中药—有效成分—靶点”网络

使用Draw Venn Diagram 工具，将SLE疾病靶点与知母-牡丹皮相关基因靶点导入，得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn图。将SLE疾病靶点与知母-牡丹皮有效成分及其相关信息导入Cytoscape3.9.1构建“中药—有效成分—靶点”网络。

4 “SLE—知母-牡丹皮”的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建

取SLE疾病靶点与知母-牡丹皮蛋白靶点的交集，将其导入String平台，选择 “Multiple proteins”，选择物种为人类，构建其PPI图，再将分析结果导入Cytoscape3.9.1，进一步对信息进行分析，筛选出关键基因。

5 交集基因的富集分析

通过Metascape数据库对筛选出来的交集基因进行分析，使用ChiPlot绘制出富集分析的气泡图，以探讨知母-牡丹皮对SLE在基因及信号通路中起关键作用的信息。

6 知母-牡丹皮主要有效成分与目标靶点进行分子对接验证

通过UniProt数据库得到目标靶点对应的PDB ID，通过其ID号在PDB数据库下载目标靶点的蛋白结构，使用PyMol软件去除蛋白结构外的其他小分子，再将其导入AutoDock Tools处理后设置为受体蛋白。在TCMSP数据库中下载有效成分的小分子结构，使用AutoDock Tools处理后设置为配体小分子。再进一步进行分子对接，将结合能最低的构象导出作为最佳结合构象，保存后用PyMol软件对其进行可视化处理。

结 果

1 知母-牡丹皮有效成分及靶点的筛选

在 TCMSP 数据库中分别搜索知母、牡丹皮，设置OB≥30%和 DL≥0.18作为筛选条件进行筛选，检索出知母-牡丹皮中化合物共有16个，利用TCMSP数据库导出其相应靶点，其中知母168个、牡丹皮200个。利用Uniprot数据库标准化命名后删除其中的重复项，最终共获得靶点193个。

2 SLE疾病靶点的筛选

以“Systemic Lupus Erythematosus”为检索词在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank和DisGeNET数据库查询疾病靶点，分别得到4906、112、30、226、33个基因。对 GeneCards 数据库中得到的结果以Gifts大于等于平均值（≥29）进行筛选得到基因3147个，将得到的所有基因进行汇总，经去重后共得到SLE相关疾病基因3224个。

3 作“SLE—知母-牡丹皮”Venn图以及构建“中药—有效成分—靶点”网络

将SLE疾病靶点与知母-牡丹皮相关基因靶点导入Draw Venn Diagram 工具，得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn图，得到交集靶点共127个（图1）。将SLE疾病靶点与知母-牡丹皮有效成分及其相关信息导入Cytoscape3.9.1，结果显示知母-牡丹皮中的16种活性化合物与127个疾病基因相互作用，共同构建“中药—有效成分—靶点”网络（图2）。分析计算得到degree值排名前五的活性化合物（表1），表明知母-牡丹皮中对SLE起主要治疗作用的有效化合物主要为槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、淫羊藿苷元（Anhydroicaritin）、豆甾醇（Stigmasterol）和薯蓣皂苷元（diosgenin）等。

表1 “知母-牡丹皮”主要活性化合物

图1 “知母-牡丹皮”药对与系统性红斑狼疮Venn图

图2 “中药-有效成分-靶点”网络图

4 “SLE—知母-牡丹皮”的PPI网络构建

取SLE靶点与知母-牡丹皮靶点的交集，127个潜在靶点，将其导入String平台，选择 “Multiple proteins”，选择物种为人类，构建其PPI初步图，再将分析结果导入Cytoscape 3.9.1，使用Tools中的Analyze Network对信息进行分析作图，根据其Degree值进行排序，并筛选出关键基因，构建PPI网络（图3），图中degree值越大，则节点越大，颜色越深，靶点之间联系越密切。排名前五的基因分别为AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53；这5个核心靶点蛋白间互作影响力最强，能在复杂的疾病调节网络中直接或间接影响其他大部分靶点通路，可能是研究药物治疗SLE的关键。

图3 知母-牡丹皮治疗SLE潜在靶点PPI网络图

5 “SLE—知母-牡丹皮”交集基因的富集分析结果

通过Metascape数据库对筛选出来的交集基因进行KEGG、GO富集分析，结果显示KEGG共获得194条富集结果，GO共获得1877条富集结果，其中GO生物过程（biological process，BP）1646条；GO分子功能（molecular function，MF）150条；GO细胞组分（cellular components，CC）81条。选取具有代表性的集群的富集结果进行可视化分析，使用ChiPlot绘制出KEGG分析图和GO分析图（图4、图5），其中横坐标为GeneRatio，纵坐标为富集到的结果名称。这进一步解释了知母-牡丹皮治疗SLE的潜在机制，帮助我们进一步了解知母-牡丹皮治疗疾病时参与的调节方式。

图4 知母-牡丹皮和SLE“交集靶点”的KEGG富集分析

图5 知母-牡丹皮和SLE“交集靶点”的GO富集分析

6 知母-牡丹皮主要活性成分与核心靶点分子对接

利用分子对接技术进一步对得到的结果进行分析，选择筛选后得到的有效成分和目标靶点进行对接，对知母-牡丹皮中有效成分治疗SLE的能力进行评估。根据表1得到的结果，选择来自知母-牡丹皮的槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蓣皂苷元这5个活性成分作为对接配体。根据PPI网络筛选出的关键基因，选取排名前5的核心靶点：AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53作为对接受体。通过结合能（Affinity）来评估有效成分与目标靶点结合的紧密程度，结合能越低表明配体与受体之间的结合越紧密。表2列举出了排名前15的对接结果。使用Pymol软件对部分结果进行进一步处理（图6），其中浅蓝色为受体蛋白，深蓝色为配体小分子，红色为配体与受体结合的氨基酸残基，黄色虚线为配体与受体之间形成的氢键。分子对接结果显示有效成分与目标靶点之间可以较好的结合。

表2 主要有效成分与目标靶点对接结果

图6 部分分子对接结构图

讨 论

在本文所示的研究中，通过网络药理学方法筛选出了16个知母-牡丹皮药对的活性成分和127个与SLE相关的基因靶点。结果表明，知母-牡丹皮药对在多组分和多目标组合治疗SLE中发挥一定的作用，对治疗SLE具有潜在优势。有医家认为SLE在急性活动期的主要证型多为热毒炽盛证，其治法多以清热为主[6]。知母和牡丹皮同属清热药，知母有清热润燥之效，牡丹皮有清热凉血之效。本研究选取degree值排名前5的活性成分和排名前5的核心基因进行分子对接，有效成分分别为槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蓣皂苷元，主要起到抗炎和免疫调节等作用；核心基因为AKT1、TNF、IL-6、VEGFA和TP53，主要在调节免疫、炎症、调控细胞生长、血管内皮细胞增殖等方面起作用。

槲皮素广泛存在于多种植物中，实验研究表明槲皮素具有降血糖、抗过敏、抗炎、抗肿瘤等作用[7]。有研究表明槲皮素具有肾脏抗炎活性，主要通过抑制肾脏中的巨噬细胞极化抑制肾小管间质损伤并且能够减少机体中的炎症因子[8]。槲皮素可以通过调节自身免疫，减少机体中的炎症因子，改善患者的肾脏功能，对狼疮肾炎有一定的指导意义[9]。山奈酚及其衍生物可以减少人体内的脂质氧化，防止器官和细胞结构恶化，具有抗菌、抗癌、保护神经和保护肝脏等作用[10]。淫羊藿苷元是一种主要来自中药淫羊藿的化合物，研究表明淫羊藿苷元可以通过调节功能，进一步调节炎症因子的释放，从而恢复异常信号通路[11]。淫羊藿苷元可以抑制调节T细胞活性，从而抑制SLE患者免疫细胞的过度活化。且实验证实其治疗小鼠肾脏损伤有一定疗效[12]。豆甾醇是一种植物甾醇，具有抗炎和镇痛作用，但其机制尚未明确。有研究表明，豆甾醇可以显著抑制促炎介质的表达，促进抗炎细胞因子的表达，从而改善机体的炎症状态[13]。薯蓣皂苷元已被证实具有抗氧化，抗炎和抗癌等的作用。薯蓣皂苷元可以明显抑制巨噬细胞的活化，抑制CD4+T细胞增殖，阻碍Th1/Th17细胞分化[14]。AKT1在蛋白质合成和细胞凋亡过程中起到重要作用，AKT1的表达增加，会使促炎细胞因子表达增加，进而Treg相关基因表达增加，提示存在与炎症活动相反的调节反馈[15]。TNF与自身免疫性疾病的易感性相关，有研究表明SLE的疾病活动评分与TNF-α水平呈现正相关[16]。IL-6由多种免疫细胞产生，有调节免疫应答等作用[17]，有研究表明IL-6水平在SLE患者中显著高于健康人，在SLE患者中，活动期高于非活动期。靶向调节IL-6的表达，有望改善SLE患者的临床症状[18]。VEGFA是一种多功能的细胞生长因子，能够促进新生毛细血管的生成，并且其是肾小球滤过屏障的关键调节因子，可能对治疗狼疮肾炎具有指导意义[19]。TP53是一种肿瘤抑制基因，具有调节细胞生长、凋亡和DNA修复的作用，有研究表明TP53与SLE发病之间存在显著关联[20]。通过以上作用机制的分析，为进一步预测知母-牡丹皮对SLE的治疗机制，我们对GO和KEGG进行了富集分析。结果表明，知母-牡丹皮在治疗SLE中参与了生物过程中的细胞对脂质、无机物、脂多糖、激素、氮化合物的反应，对细胞外刺激的反应等；分子功能中的转录因子结合、细胞因子受体结合、蛋白激酶活性等；细胞组分中的转录调节剂复合物、膜筏、囊泡腔等。KEGG显示知母-牡丹皮治疗SLE涉及的通路主要有钙信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、cAMP信号、松弛素信号通路及Apelin信号通路等。这些通路在免疫调节、炎症反应、调节血流、信号传导等方面有重要意义。

本文综合了网络药理学和分子对接，初步从分子水平上展示了知母-牡丹皮的多组分、多靶点、多通道治疗SLE的现代应用价值，从而为知母-牡丹皮临床治疗SLE提供指导意义。