探究菟丝子-枸杞子治疗糖尿病性骨质疏松症的作用机制*

马桃梅，韩世杰，王晶，马欢欢，王晓晖

1 甘肃中医药大学 甘肃兰州 730000

2 甘肃省中医医院 甘肃兰州 730050

随着我国经济水平的逐步提高，饮食结构的改变，人口老龄化的加剧以及遗传等因素的影响，糖尿病发病率逐年升高且趋向于年轻化。2型糖尿病（T2DM）是一种常见的代谢性疾病，其主要特征是以胰岛素作用障碍或分泌不足所引发的高血糖[1]，其作为全身性代谢紊乱疾病，不仅与三大物质代谢有关，而且与钙、磷、镁等矿物质代谢关系密切，从而产生肾病、视网膜病变、糖尿病足及骨骼系统疾病等100多种多系统并发症[2]，其中2型糖尿病性骨质疏松症（Diabetic osteoporosis，DOP）作为2型糖尿病在骨骼系统中最常见的慢性并发症，国内外研究[3-5]均证实，2型糖尿病患者存在骨量丢失，2型糖尿病继发骨质疏松发生率高达49.02%，主要临床特点为腰背、髋部疼痛、持续肌肉疼痛，并伴有活动受限，早期无明显的症状、体征，严重时行走困难，身长缩短，容易骨折，为患者生活带来极大影响。

医学古籍中尚无关于2型糖尿病性骨质疏松的记载，糖尿病在中医学中归属于“消渴病”范畴，而骨质疏松症根据其临床表现应归属于“骨痿”“骨痹”“骨枯”“腰腿痛”等病症[6]，目前尚无统一的中医命名，不过多数医家认为“骨痿”是比较准确的描述。糖尿病在中医学中属于“消渴”范畴，其基本病机是阴虚燥热，病变脏腑涉及肺、胃、肾三脏，以肾为主，因此认为糖尿病性骨质疏松症的病因病机是由于消渴阴虚内热日久，耗气伤肾，肾精亏虚，髓海不足，骨失所养，骨枯髓减，最终导致骨质枯槁发为“骨枯”“骨痿”等[7-8]。现代多数医家也认为肾脏虛衰，髓海不足是糖尿病性骨质疏松症的关键病机。菟丝子味甘、温，归肾、肝、脾经，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、 止泻之功效[9]。枸杞子味甘，性平，归肝、肾经，有滋肝补肾、益精明目的功效[10]。两药都入肝肾经，是临床上补益肝肾、滋阴益髓的常用药物，具有较好的疗效。本文通过中药网络药理学探究菟丝子-枸杞子药对治疗DOP可能潜在作用靶点和信号通路，为临床开发新的方药提供方向。

材料和方法

1 数据库与软件

见表1。

表1 数据库与软件

2 中药活性成分及其作用靶点筛选

使用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP） 以口服生物利用度（ OB） ≥30%、类药性（DL）≥0.18进行菟丝子-枸杞子活性成分的筛选。

3 构建小分子化合物对应靶标数据库

将1.步查询到的小分子化合物依次作为关键词放入相应药物的 TCMSP 数据库中查询，设置查询结果为 Targets Information，得到各个化合物对应靶标蛋白合并，并通过Uniprot数据库转换出作用靶点的通用基因名称，建立中药化学成分-靶点数据库。

4 DOP疾病靶点的提取

使用糖尿病性骨质疏松症的英文检索术语（Diabetic osteoporosis）在Drug Bank、OMIM、PharmGkb数据库查询DOP相关靶点，剔除非人源基因，绘制疾病靶点交集基因venn图。

5 中药靶点与疾病相关基因韦恩（Venn）图的绘制

利用R软件进行中药靶点与疾病相关基因韦恩（Venn）图的绘制，图中交集靶点即为菟丝子-枸杞子抗DOP的作用靶点。利用这些基因为桥梁构建中药后续的调控网络。

6 蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络的构建

将中药靶点-疾病基因交集文件输入到String数据库中，将物种设定“Homo sapiens”、参数设置为0.9，获得PPI的数据文件。随后将此文件导入Cytoscape3.8.0软件，获得蛋白PPI网络图，根据PPI网络图中各靶点的点度中心性（degree）、中介中心性、接近中心性等拓扑学参数筛选出关键靶点。这些参数值越大说明此节点在网络中越重要，选取数据排名靠前的核心靶点蛋白。

7 GO、KEGG分析

使用DAVID数据库对中药干预DOP靶点进行功能的富集分析，包括GO功能富集、京都基因与基因组百科全书通路富集（KEGG）分析，GO分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）的富集分析。

结 果

1 菟丝子-枸杞子活性成分及作用靶点

按照OB≥30%、DL≥0.18在TCMSP数据进行中药活性成分的筛选，共得到56种，其中菟丝子11种、枸杞子45种（图中仅列出符合OB、DL条件排名前10的成分，见表2）。同时，筛选出菟丝子-枸杞子药对作用靶点共 705个。

2 DOP疾病相关基因及相关的菟丝子-枸杞子作用靶点

以糖尿病性骨质疏松症的英文为检索术语 （Diabetic osteoporosis）在Drug Bank、OMIM、PharmGkb数据库查询到3195个与DOP相关靶点，进行了三大数据库疾病交集靶点图的绘制（图1）。然后进行了药物靶点和疾病靶点韦恩图的绘制获得的交集基因共143个，

图1 疾病靶点Venn图

作为菟丝子-枸杞子治疗DOP的潜在靶点进行后续分析（图2）。

图2 中药-疾病交集靶点

3 “中药-疾病-靶点”可视化网络图

利用 Cytoscape3.8.0软件构建“药物-疾病-靶点”网络图，共得到 185个节点，其中中药治疗 DOP有效成分节点42个，疾病与药物交集靶点143个。图中紫色圆圈代表菟丝子活性成分，红色圆圈代表枸杞子活性成分，蓝色方块代表药物干预疾病潜在靶点，连线代表着化合物与靶点之间相互作用关系（图3）。

图3 中药-疾病-靶点网络图

4 PPI网络图构建

将药物与疾病共有的143靶点上传String数据库获取蛋白之间的作用关系，构建蛋白相互网络（图4），其中节点代表基因，连线代表蛋白互作关系，不同颜色代表不同证据。然后将网络导入到 Cytoscape3.8.0软件中利用 CytoNCA 插件进行计算网络节点的度中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心性 （EC）、网络中心性（NC）和局部边连通性（LAC），得到上述值的中位数，小于中位数的靶点则去除。第一次分析得到核心基因网络共包含了123个靶基因。第二次分析得到核心基因网络共包含33个重要靶基因。 最终分析得到核心靶基因共12个（图5）。表3为最终核心基因在各个参数的得分值。

图4 PPI网络图

图5 核心靶基因

表3 最终核心基因得分值

5 GO 和 KEGG 分析

在GO富集分析中共得到2427条，其中生物学进程 （ biological process，BP）2195条，细胞组分（cellular component，CC） 77条，分子功能 （molecular function，MF） 155条，根据 P值从小到大筛选 BP、CC和 MF 排名前十绘制柱状图（图6）和气泡图（图7）。BP重要富集在细胞外刺激的反应、营养水平、氧化应激反应、氧活性（含量）反应等。CC 涉及最高的条目包括膜筏、膜微区、胞质囊腔等。MF 中富集最高的包括DNA-结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、脱氧核糖核酸结合性转录激活蛋白等。KEGG 通路富集分析共得到158个富集条目，选取前30个 进行分析显示柱状图（图8）和气泡图（图9），其中脂质与动脉粥样硬化、流体剪应力与动脉粥样硬化糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、癌症相关信号通路、肿瘤坏死因子信号通路（TNF）、IL-17信号通路、肝炎相关信号通路等信号通路可能与菟丝子-枸杞子治疗 DOP 机制密切相关。

图6 GO分析的柱状图

图7 GO分析的气泡图

图8 KEGG通路分析的柱状图

图9 KEGG通路分析的气泡图

讨 论

2型糖尿病性骨质疏松症发生发展的根本在于肾虚，涉及脾、肝，三脏之间相互影响，病理表现为精气不足，骨髓空虚，骨质脆弱。菟丝子-枸杞子药对是中医临床治疗DOP的常用药对，具有补肾填精、调节肾阴阳平衡的功效，是补肾益精类方剂中的常用药对[11]。现代药理学研究菟丝子具有免疫调节、改善心脑血管、保肝、降血糖、调节内分泌、营养神经、骨损伤修复等作用[12-13]。枸杞子具有降血糖、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血脂、抗脂肪肝等作用，大量临床实践也证明两药合用可以治疗DOP。然而，菟丝子-枸杞子药对治疗DOP的潜在机制仍不清楚，因此，本文设计了网络药理学方法进一步探索药对的药理机制。

通过筛选得到菟丝子-枸杞子的活性成分共56种，其中β-谷甾醇，槲皮素、山柰酚、芝麻素等成份节点度值较高说明这些化合物在抗DOP中起重要的作用，其中β-谷甾醇是一种植物甾醇，现代药理学发现其具有抗氧化、抗炎、镇痛、降血糖、免疫调节等作用。王鹏等[14]通过细胞实验证明槲皮素能显著改善骨小梁结构数量，增加骨密度，对废用性骨质疏松有明显预防作用；其机制与槲皮素可抑制 ERK1/2、MAPK mRNA 和蛋白的表达，从而抑制 ERK1/2-MAPK 信号通路的传导有关。刘军等[15]通过补充槲皮素辅助双膦酸盐治疗老年性骨质疏松患者临床观察，发现可以显著改善患者骨密度指标、疼痛症状、功能障碍情况及骨代谢指标的异常表达，提升患者生活质量。王艳等[16]发现槲皮素可通过调节骨组织中OPG、RANKL的相对含量而抑制骨吸收，防止骨质疏松。现代药理研究表明，山奈酚具有抗癌、抗炎、抗骨质疏松、降糖、免疫调节和修复损伤组织等作用[17]。曾意荣等[18]发现山柰酚能够激活雌激素受体的活性，促进成骨细胞增殖，提高成骨细胞分化和矿化能力。马忠平等[19]发现芝麻素有通过调节 Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的趋势，对重塑大鼠骨结构有一定影响，对骨质疏松有治疗和预防作用。

本研究结果表明，菟丝子-枸杞子的主要有效成分可通过多个靶点、多个信号通路影响DOP的发生。其中TP53、JUN、MAPK14、ESR1、RELA等对DOP的发生发展有重要作用。这些基因可通过DNA-结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、脱氧核糖核酸结合性转录激活蛋白、配体激活的转录因子活性等影响DOP的发生，即主要影响细胞因子及细胞因子受体、转录因子等从分子水平上干预骨质疏松[20]。

KEGG富集分析显示血脂和动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路注释基因数相对较多，近年来，脂质与骨代谢之间的关系日益成为人们关注的焦点，越来越多的证据表明，动脉粥样硬化（AS）和骨质疏松（OP）经常同时存在。基于实验室和临床的试验表明，脂肪细胞的增加伴随着骨密度（BMD）和骨量的减少，用于治疗高脂血症的降脂药物他汀类也对DOP的治疗有益处[21]。因此，有证据表明脂类代谢与骨代谢相关，两者相互调节。一项横断面研究研究发现，骨质疏松和动脉粥样硬化是共病的，同时发现了一个脂质组模块及其特定的分子脂质，它与骨质疏松和动脉粥样硬化亚临床期的替代标记物显著相关。所发现的脂类代谢的改变可能有助于共病条件，并为其双基础预防方法带来新的可能性[22]。Suzuki等[23]研究发现体内高水平AGE使骨蛋白及骨细胞分化受到影响，导致骨形成减少，骨胶原连接障碍，骨的质量降低，脆性增加，引发骨质疏松。Zhang等[24]研究发现，在AGEs作用下，骨细胞样MLO-Y4细胞中FOXO1基因、促凋亡基因（P53等）及下游靶基因Bax 表达增加，caspase-3活化增强，诱发骨细胞凋亡，致使骨代谢失衡。持续性高血糖状态可导致晚期糖基化终产物（AGEs）的积累和激活晚期糖基化终产物（RAGE）信号受体，AGE-RAGE信号激活可诱导骨髓间充质干细胞（BMSC）功能障碍，使骨髓间充质干细胞成骨分化减少、炎症增强、活性氧产生和BMSC凋亡[25]。因此菟丝子-枸杞子可通过抑制AGE-RAGE信号，减弱高糖介导的骨髓间充质干细胞功能障碍，可能是糖尿病性骨质疏松症的潜在治疗方法。AGEs可通过调节AGEs受体（RAGE）促进破骨细胞骨吸收，抑制成骨细胞骨形成。此外，AGEs破坏骨质量并通过改变骨材料成分增加骨折风险[26]。研究表明测量血清中sRAGE的水平可能在骨质疏松进展的监测中具有潜在的诊断作用，特别是在从预防和筛查阶段到骨质减少水平到骨质疏松的骨折风险评估中[27]。

综上所述，本研究从网络药理学角度对菟丝子-枸杞子治疗DOP的潜在活性成分、关键基因和关键通路、机制进行了阐述，并通过细胞分子实验证实了该药对治疗 OP 的协同增效作用。 结果提示该药对在DOP的治疗中可能涉及不同靶点和通路延缓DOP的进 展，体现了中医药治疗多靶点、多途径的治疗特点。