云南重楼果皮高效液相色谱指纹图谱研究

苏会梅，陆礼和，余 丽，徐宏盼，万近福，△

（1.昆明医科大学药学院·云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500； 2.云南省药物研究所·云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111）

云南重楼Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.为百合科重楼属植物，收载于历版《中国药典（一部）》，并规定以干燥根茎入药，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效［1］。重楼地上部位一年一生资源丰富，但常大量丢弃，造成浪费。不少学者对其开展了化学成分和药理活性［2-7］研究，发现皂苷类成分为主要活性成分［8］。刘佳等［9-10］比较了同种重楼不同部位（叶片、地上茎、种子、果皮、外种皮）、不同种重楼不同部位中重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的含量，发现含量相差较大，不同部位均含有重楼皂苷Ⅶ，含量依次为果皮> 外种皮> 叶片> 种子> 地上茎；仅果皮和叶片含有重楼皂苷Ⅰ，且叶片>果皮。李燕敏等［11］采用超高效液相色谱- 四极杆- 飞行时间串联质谱（UPLC -QTOF - MS/ MS）法结合高效液相色谱（HPLC）法对华重楼根茎、须根、茎、叶、种子、果皮的化学成分进行分析，发现根茎、须根、种子的化学成分相似，均以偏诺皂苷为主；果皮同时含有偏诺皂苷和薯蓣皂苷，以偏诺皂苷含量居高，主要为重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H。为更好地开发和利用云南重楼果皮，本研究中建立了云南重楼果皮化学成分的HPLC 指纹图谱［12-15］，旨在为云南重楼果皮的质量控制及合理开发提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate3000 型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司），配有LC-20AT型四元泵、SIL-20A型自动进样仪、CTO-20A 型柱温箱、SPDM-20A 型紫外检测器；XSE205 型电子天平（精度为0.01 mg），ME 204T/02型电子天平（精度为0.01 mg），均购自梅特勒-托利多仪器< 上海> 有限公司；DZKW - S - 6 型智能数显恒温水浴锅（巩义市予华仪器预先责任公司）；ADVANTAGA10型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

云南重楼果皮由云南白药集团太安中药材生产质量管理规范（GAP）种植基地提供，经云南省药物研究所苏钛正高级工程师鉴定为正品，批号分别为20221028-4（S1，4 年生）、20221028 - 5（S2，5 年生）、20221028 - 6（S3，6 年生）、20221028-M（S4，多年生）、20221028-7（S5，5 mm圆）、20221028-8（S6，5 mm长）、20221028-9（S7，3～5 mm 圆）、20221028 - 10（S8，3～5 mm 长）、20201109（S9）；重楼皂苷Ⅰ对照品（批号为111590 -202105），重楼皂苷Ⅱ对照品（批号为111591 -20210504），重楼皂苷Ⅵ对照品（批号为111592 -201604），重楼皂苷Ⅶ对照品（批号为111593 -202105），均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于96.0%；重楼皂苷Ⅲ对照品、重楼皂苷D对照品、重楼皂苷H 对照品、kaempferol - 3 -O-β-D- galactopy⁃ranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside（CLD02）对照品、isorhamnetin - 3 -O-β-D- galactopyranosyl -（1 →6）-β-D- glucopyranoside（CLD03）对照品、异鼠李素-3-O-β-D-龙胆二糖苷（CLD04）对照品、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（CLD01）对照品均为实验室自制，经核磁、质谱数据及文献对比后确定其结构，HPLC 检测质量分数均大于95.0%；乙腈（美国Merck公司，色谱纯）；超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脱（0～60 min 时10%A～50%A，60～65 min 时50%A～80%A，65～85 min 时80%A～90%A，85～95 min 时90%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：15µL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷D、重楼皂苷H对照品各适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.415，0.571，0.525，0.419，0.463，0.416，0.494 mg/mL 的重楼皂苷混合对照品溶液。分别取CLD02，CLD03，CLD04对照品各适量，加水制成质量浓度分别为4.16，4.32，3.86 mg/mL 的CLD 混合对照品溶液。取CLD01对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1.52 mg/ mL 的对照品溶液。

供试品溶液：取药材样品粉末（过3 号筛）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，称定质量，80 ℃恒温水浴锅中加热回流60 min，放冷，再次称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL；回收溶剂至干，残渣加水10 mL使溶解，用水饱和正丁醇提取5次，每次15 mL，合并正丁醇液，蒸干；残渣用5 mL甲醇溶解，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察［16］

精密度试验：参照2020 年版《中国药典（四部）》通则0512 HPLC 法，取药材样品（批号为20201109）粉末1.0 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录色谱图，以重楼皂苷Ⅶ峰为参照峰。结果各共有峰相对峰面积的RSD小于1.98%（n= 6），相对保留时间的RSD小于0.48%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：参照2020 年版《中国药典（四部）》9101 药品质量标准分析方法验证指导原则，取药材样品（批号为20201109）粉末1.0 g，共6 份，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以重楼皂苷Ⅶ为参照峰。结果各共有峰相对峰面积的RSD小于2.04%（n=6），相对保留时间的RSD小于0.42%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：参照2020 年版《中国药典（四部）》9101 药品质量标准分析方法验证指导原则，取药材样品（批号为20201109）粉末1.0 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，12，16，20，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以重楼皂苷Ⅶ为参照峰。结果各共有峰相对峰面积的RSD小于1.54%（n=7），相对保留时间的RSD小于0.39%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取药材样品（批号为20201109）粉末0.5 g，精密称定，共6份，分别精密加入重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷Ⅱ对照品5.280 0 mg 和2.206 0 mg，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ的平均加样回收率分别为106.11%和102.45%，RSD分别为0.53%和1.10%（n=6），表明结果准确度好。

2.4 指纹图谱建立与相似度评价

取9 批药材样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版，以药材样品S1 的色谱图为参照谱图，采用中位数法生成对照谱图，时间窗宽度设置为0.1 min，匹配方法为多点校正法，建立共有模式，共标记16 个共有峰，并生成指纹图谱，见图1和图2。

图1 9批药材样品高效液相色谱叠加指纹图谱Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of nine batches of Paridis Pericarpium

图2 药材样品高效液相色谱对照指纹图谱Fig.2 HPLC reference fingerprint of Paridis Pericarpium

8 号峰为重楼属植物的特征标志峰（重楼皂苷Ⅶ），峰面积较大且与其他相邻峰分离度良好，故定为参照峰（S）。计算其他共有峰的相对峰面积和相对保留时间，各共有峰相对峰面积的RSD均不低于22.21%，各共有峰相对保留时间的RSD均不超过0.62%，详见表1。9 批药材样品的HPLC 指纹图谱相似度评价结果见表2。

表1 9批药材样品高效液相色谱共有峰的相对峰面积和相对保留时间Tab.1 Relative peak areas of common peaks in the HPLC chromatograms of nine batches of Paridis Pericarpium

表2 9批药材样品相似度评价结果Tab.2 Results of similarity evaluation of nine batches of Paridis Pericarpium

2.5 特征峰归属和指认

取2.2 项下供试品溶液及对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。共指认9个成分，包括4 个黄酮类成分及5 个重楼皂苷类成分，分别为kaemp⁃ferol- 3 -O-β-D- galactopyranosyl-（1 →6）-β-D- glucopyranoside（峰2）、isorhamnetin-3-O-β-Dgalactopyranosyl-（1 →6）-β-D-glucopyranoside（峰3）、异鼠李素-3-O-β-D-龙胆二糖苷（峰4）、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（峰5）、重楼皂苷Ⅶ（峰8）、重楼皂苷D（峰9）、重楼皂苷H（峰10）、重楼皂苷Ⅲ（峰12）、重楼皂苷Ⅰ（峰13）。详见图3。

A.重楼皂苷混合对照品溶液 B.CLD01对照品溶液C1- C3.CLD混合对照品溶液（CLD02，CLD03，CLD04）2.Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranosyl-（1 →6）-β-Dglucopyranoside 3.Isorhamnetin-3-O-β-D-galactopyrano⁃syl-（1 →6）-β-D-glucopyranoside 4.异鼠李素-3-Oβ -D-龙胆二糖苷 5.异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷8.重楼皂苷Ⅶ 9.重楼皂苷D 10.重楼皂苷H 12.重楼皂苷Ⅲ13.重楼皂苷Ⅰ 17.重楼皂苷Ⅱ 18.重楼皂苷Ⅳ图3 对照品溶液高效液相色谱图A.Mixed reference substance of polyphyllin B.CLD01 reference solu⁃tion C1-C3.CLD reference solution（CLD01，CLD03，CLD04）2.Kaempferol-3-O-β-D-galactopyranosyl-（1 →6）-β-D-glu⁃copyranoside 3.Isorhamnetin-3-O-β-D-galactopyranosyl-（1 →6）-β-D-glucopyranoside 4.Isorhamnetin-3-O-β-D-gentiano⁃side 5.Isorhamnetin 3-O-β-D-glucoside 8.Polyphyllin Ⅶ9.Polyphyllin D 10.Polyphyllin H 12.Polyphyllin Ⅲ 13.Polyphyllin Ⅰ17.Polyphyllin Ⅱ 18.Polyphyllin ⅣFig.3 HPLC chromatograms

3 讨论

3.1 色谱条件优化

预试验中参照2020年版《中国药典（一部）》重楼含量测定项下相关要求，对不同流动相（甲醇- 水、乙腈-水、甲醇- 0.1%磷酸水溶液、乙腈- 0.1%磷酸水溶液），不同色谱柱［Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）、YMC J'sphere ODS-H80 柱（250 mm×4.6 mm，5µm）、Xtimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）、Zorbax SB - Aq 柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）、Zorbax Eclipse XDB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）、Ecosil HPLC Column 柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）］，不 同 流 速（0.9，1.0，1.1 mL/min），不同温度（28，30，32 ℃）进行了考察，采用梯度洗脱，对色谱条件进行优化，发现洗脱系统为乙腈- 水，流速为1.0 mL/ min，色谱柱为Capcell PAK C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）时各成分分离效果好，峰形好；温度对分离效果影响不大，基于实验室常用柱温，故选定柱温为30 ℃；通过对供试品溶液进行180～500 nm 波长范围内扫描，发现各成分于203 nm波长处出峰较多，故选定检测波长为203 nm。

3.2 供试品溶液制备方法选择

对不同提取方式（超声提取、回流提取），提取溶剂（50%，75%，100%，50%，75%，95%乙醇），提取时间（30，60，120 min），提取液料比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，50∶1，100∶1，mL/g）进行考察，以重楼皂苷Ⅶ的峰面积和峰形作为判断依据。结果表明，50倍75%甲醇回流提取60 min效果最佳。

3.3 指纹图谱相似度评价

通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0 版对9 批药材样品进行分析，共确定了16 个共有峰，相似度为0.903～0.980，各共有峰相对保留时间的RSD均不超过0.62%，表明HPLC 指纹图谱体系稳定，可为云南重楼果皮的质量控制提供参考。但相对峰面积的RSD相差较大，为排除试验误差，在此基础上补充了重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷Ⅱ的加样回收试验，结果平均加样回收率分别为106.11%和102.45%，RSD分别为0.53%和1.10%，提示不同批次、不同采收年限的云南重楼果皮品质存在较大差异。

3.4 方法评价

本研究中建立的方法精密度高、重复性好、稳定性强，能较好地反映云南重楼果皮中化学成分的HPLC 指纹图谱，可为云南重楼果皮的整体质量控制和评价提供参考。