滑胎安胎协定方促进滋养细胞迁移侵袭治疗复发性流产的作用机制研究

张旻轶 楼毅云

据文献报道，复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）在育龄妇女所有妊娠中的占比为2%～5%，且呈逐年上升趋势，严重危害患者的生育健康[1-2]。妊娠成功与否和胎儿绒毛外滋养细胞以及母体蜕膜免疫细胞功能密切相关。目前临床治疗策略以对因治疗为主，对于原因不明的RSA，暂无特异性的治疗手段[3]。因此，探究RSA 的具体发病机制并寻找有效的治疗方法具有重要临床意义。研究表明，滋养细胞的生物学行为可能在RSA 发生、发展中起重要作用，如蜕膜巨噬细胞（decidual macrophage，DM）可通过分泌粒细胞集落因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）来参与调控滋养细胞，从而在早期妊娠中发挥作用[4-5]。滑胎安胎协定方系名老中医临证经验方，笔者前期研究发现其可调节妊娠早期子宫内膜蜕膜化进程，从而减少肾虚型RSA 的发生[6]。本研究采用滑胎安胎协定方干预DM 和滋养细胞，通过观察DM 分泌G-CSF，滋养细胞增殖活性、迁移和侵袭情况以及磷脂酰肌醇三羟基激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/细胞外调节蛋白激酶（extracellularly regulated protein kinases，ERK）和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白表达，从而探究滑胎安胎协定方干预DM 分泌G-CSF 调控滋养细胞进而影响RSA 发生的可能机制，以期为临床治疗RSA 提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料 HTR-8/SVneo人胚胎滋养细胞（批号：CM-0599）购于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。滑胎安胎协定方药材包括菟丝子（批号：20220223）、覆盆子（批号：20220413）、苎麻根（批号：20220308）、桑寄生（批号：20220118）、当归（批号：20220310）、阿胶（批号：2101013）、杭白芍（批号：20220411），均购于华东医药股份有限公司药材参茸分公司，由浙江省立同德医院药房煎制[具体煎制方法：取菟丝子、覆盆子、苎麻根、桑寄生各80 g，当归、阿胶、杭白芍各60 g，共计500 g。将500 g 原药碾压成粉状后加入2 000 mL 蒸馏水煮沸，慢沸2.5 h，过滤残渣收集滤液；再次加入2 000 mL 蒸馏水煮沸，收集滤液。将两次收集的滤液置于60 ℃旋转蒸发浓缩过滤，得到200 mL 滑胎安胎协定方中药液（相当于每毫升药液中含2.5 g 原药）][6]。分化簇（cluster of differentiation，CD）14 抗体（批号：5211204890）购于德国Miltenyi Biotec 公司；CD14 抗体（61D3）FITC（批号：F1609）购于美国Santa 公司；波形蛋白（Vimentin）抗体（批号：GR3333721-16）购于英国Abcam 公司；AKT、ERK、磷酸化ERK（p-ERK）、上皮细胞钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（批号：4、28、28）购于美国CST 公司；磷酸化AKT（p-AKT）抗体（批号：20t9742）购于英国Affinity 公司；IL-4（批号：20200422）购于北京索莱宝科技有限公司；G-CSF 试剂盒（批号：MM-0040H2）购于江苏酶免实业有限公司；细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）试剂盒（批号：92820210318）购于上海碧云天生物技术有限公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（批号：28718-90-3）购于美国Sigma 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批号：3292）购于苏州吉玛基因股份有限公司。AE2000 光学显微镜购于厦门麦克奥迪实业集团有限公司；Micro17R 低温高速离心机、BB150 细胞培养箱购于美国Thermo 公司；NovoCyte 流式细胞仪购于美国Agilent 公司；CMaxPlus 酶标仪购于美国MD 公司；EPS300 电泳仪、VE 180C 电泳槽、VE186转膜仪购于上海天能科技有限公司；610020-9Q 化学发光仪购于上海勤翔科学仪器有限公司。

1.2 DM 原代分离及荧光鉴定 经浙江省立同德医院医学伦理委员会审查通过（批准文号：浙同德伦审2022 研第037 号-JY），符合中西医诊断标准[6]，选取2022 年7 月在浙江省立同德医院妇科计划生育门诊就诊的妊娠早期（妊娠＜12 周）流产患者1 例，经患者知情同意后取流产蜕膜组织，使用0.9%氯化钠溶液充分清洗，消化液消化，1 000 r/min 离心5 min；用Midi-MACS 缓冲液重悬细胞沉淀，加入CD14 磁珠置于4 ℃冰箱孵育，将MACS 磁柱固定在分离器上，进行细胞过柱；收集磁柱上的细胞，1 000 r/min 离心5 min，重悬细胞沉淀，置于细胞培养箱内培养。取上述细胞悬液种板，4%多聚甲醛固定，加入Triton X-100 通透细胞膜，封闭液封闭；加入CD14 抗体孵育，漂洗，加二抗，孵育30 min，加入DAPI 染色，漂洗，封片，采用荧光显微镜拍照观察。采用免疫荧光法进行巨噬细胞CD14 抗体的再次鉴定，确定所分离的细胞为DM，富集的蜕膜巨噬细胞纯度约90%，见图1（插页）。

图1 DM 荧光鉴定结果（×200）

1.3 滑胎安胎协定方含药血清的制备 取无特定病原体的雌性SD 大鼠6 只，体重约250 g，购于上海吉辉实验动物饲养有限公司[许可证号：SCXK（沪）2017-0012]，饲养于浙江鹰旸医药研发有限公司[许可证号：SYXK（浙）2021-0033]。按随机数字表法分为中药组（1.8 mL 滑胎安胎协定方中药液）和空白对照组（1.8 mL 0.9%氯化钠溶液），均灌胃给药，1 次/d，连续7 d，末次给药后1 h 采集血清，过滤后-20 ℃冻存待用。所有动物实验步骤经浙江鹰旸医药研发中心实验动物伦理委员会审查通过（批准文号：ZJEY-20220602-02）。

1.4 DM 和滋养细胞分组 （1）DM 分组：将培养好的DM 分为中药干预组（10%滑胎安胎协定方含药血清）、IL-4 诱导组（10 ng/mL IL-4）和空白对照组（10%空白血清），干预72 h。（2）滋养细胞分组：将HTR-8/SVneo细胞接种于Transwell 小室的上室中，下室分别为DM、DM+10%滑胎安胎协定方含药血清、400 ng/mL G-CSF（预实验提示400 ng/mL 为最合适剂量，滋养细胞存活率较高）、10%空白血清，构建细胞共培养体系，分为DM组、DM+中药组、G-CSF组和空白对照组，共培养48 h。

1.5 DM 分型检测 采用流式细胞术。取DM，胰酶消化贴壁细胞，PBS 洗涤2 次，PBS 重悬细胞；加入相应抗体，避光孵育30 min；PBS 洗涤2 次，加入PBS 重悬细胞，使用流式细胞仪检测DM 分型，以CD80 标记M1 型DM，CD163 标记M2 型DM[7]。

1.6 DM 中G-CSF 含量检测 采用ELISA 法。取DM，用PBS 稀释细胞悬液至浓度为1×107个/mL；冻融细胞，3 000 r/min 离心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存，参照G-CSF ELISA 试剂盒说明书检测各组DM中G-CSF 含量。

1.7 滋养细胞存活率检测 采用CCK-8 法。将HTR-8/SVneo 细胞接种于96 孔板内，培养48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂于培养箱内孵育；使用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（absorbance，A）值，计算各组滋养细胞存活率。细胞存活率=（实验组A 值-空白调零A值）/（对照组A 值-空白调零A 值）×100%。

1.8 滋养细胞迁移能力检测 采用划痕实验。将HTR-8/SVneo 细胞接种于已标记的6 孔板内，培养至铺满板孔后，使用移液枪枪头于垂直板底部作横线划痕；PBS 漂洗，弃去划痕下细胞，继续培养；于0、24 h 观察划痕情况并拍照，使用Image J 软件分析并计算各组滋养细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h 划痕宽度-培养24 h 后划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%。

1.9 滋养细胞侵袭能力检测 采用Transwell 实验。取30 μL 无血清DMEM 高糖培养液按3∶1 比例制备的Matrigel 稀释液，均匀包被Transwell 小室，4 ℃孵育过夜；将Transwell 小室放入24 孔板内，上室加入HTR-8/SVneo 细胞，培养24 h；使用棉签轻擦上层未迁移细胞，固定液固定，PBS 漂洗，0.1%结晶紫染色后拍照并计数侵袭至下室的细胞数量，即细胞侵袭数量。本实验重复3 次取平均值。

1.10 滋养细胞PI3K/AKT/ERK 和EMT 相关因子蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。取HTR-8/SVneo细胞，RIPA 裂解液裂解，提取总蛋白，二辛可宁酸法测定蛋白含量；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭后加入一抗，4 ℃孵育过夜；加入相应二抗，室温孵育1 h，TBST 漂洗。以GAPDH 为内参，电化学发光仪显影，使用chemi caPture 软件定量分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。

1.11 统计学处理 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组DM 分型检测结果比较 与空白对照组比较，中药干预组、IL-4 诱导组DM 数量均明显减少（均P＜0.05），M2 型DM 数量均明显增加（均P＜0.05），而M1 型DM 数量比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图2。

图2 3 组DM 分型检测结果比较

2.2 3 组DM 中G-CSF 含量比较 中药干预组、IL-4诱导组、空白对照组DM 中G-CSF 含量分别为（95.75±9.64）、（127.62±9.72）、（65.55±7.75）ng/L，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中中药干预组、IL-4 诱导组均明显高于空白对照组（均P＜0.05）。

2.3 4 组滋养细胞存活率比较 DM 组、DM+中药组、G-CSF组、空白对照组滋养细胞存活率分别为（112.20±6.04）%、（121.97±7.37）%、（143.35±8.38）%、（100.00±7.79）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中DM 组、DM+中药组、G-CSF 组均明显高于空白对照组（均P＜0.05）。

2.4 4 组滋养细胞迁移能力比较 4 组滋养细胞迁移率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中DM 组、DM+中药组、G-CSF 组滋养细胞迁移率均明显高于空白对照组（均P＜0.05），见图3（插页）。

图3 4 组滋养细胞迁移能力比较

2.5 4 组滋养细胞侵袭能力比较 4 组滋养细胞侵袭数量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中DM 组、DM+中药组、G-CSF 组滋养细胞侵袭数量均明显多于空白对照组（均P＜0.05），见图4（插页）。

图4 4 组滋养细胞侵袭能力比较（×200）

2.6 4 组滋养细胞PI3K/AKT/ERK 和EMT 相关因子蛋白表达水平比较 4 组滋养细胞p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERK1/2、Vimentin、E-cadherin 蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而AKT、ERK1/2 蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；其中DM 组、DM+中药组、G-CSF 组滋养细胞p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERK1/2、Vimentin 蛋白表达水平均明显高于空白对照组（均P＜0.05），DM+中药组、G-CSF组E-cadherin 蛋白表达水平均明显低于空白对照组（均P＜0.05），见图5。

图5 4 组滋养细胞PI3K/AKT/ERK 和EMT 相关因子蛋白表达水平比较

3 讨论

滋养细胞来自胚胎外滋养层，在胚胎发育过程中发挥滋养功能，而滋养细胞的迁移和侵袭对于胚胎着床和正常妊娠至关重要，滋养细胞功能障碍是引发RSA 的重要原因之一[4]。Fan 等[8]研究表明，滋养细胞可以分散成单独的细胞株，并通过增殖、迁移、侵袭进入子宫蜕膜并发挥其作用。在生理妊娠中，DM 在协助滋养细胞迁移、侵袭以及形成母胎免疫耐受环境的过程中起着重要作用。研究发现，M2 型DM 是成功妊娠的关键，而M1 型DM 可能导致RSA 发生[9-10]。Ding等[11]研究表明，由M2 型DM 分泌的G-CSF 能够调节子宫内膜免疫细胞和滋养细胞的功能，在母体与胎儿之间的相互作用中起重要调节作用。

在中医角度，RSA 属“滑胎”“数堕胎”“屡孕屡堕”范畴，其病因在于母体损伤和胎元不健，多为肾虚肝郁、气血虚弱，兼有脾胃虚寒、气血瘀滞[12-13]。临床上应结合病因辨证论治，以标本同治为纲，以益气养血、补肾益肾为治疗之根本，同时辅以补益脾胃、行气活血[14]。本研究所用的滑胎安胎协定方中菟丝子补肝肾安胎，为君药；覆盆子益肾固精，为臣药；苎麻根凉血止血安胎，桑寄生补肝肾安胎，共为佐药；当归、阿胶、杭白芍养血活血、益肾固精，促进胚胎发育；诸药相配能起到益气养血、补肾安胎之功。现代药理学研究发现，菟丝子提取物可通过增加早孕滋养层细胞的增殖活性，从而减少DM 凋亡[15]；苎麻根可提高血清中激素孕酮和人绒毛膜促性腺激素水平，进而调节外周血和胎盘组织中的Th1/Th2/Th17/调节性T 细胞，从而发挥保胎、安胎的作用[16]。本研究发现，经DM、DM+滑胎安胎协定方含药血清、G-CSF 分别干预后，滋养细胞存活率、迁移率均明显升高，侵袭数量均明显增加，提示滑胎安胎协定方可能的作用机制是通过诱导DM 极化来促进G-CSF 分泌，从而增强滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力，可能与菟丝子有效成分能增加滋养层细胞增殖活性和减少DM 凋亡有关[15]。

G-CSF 在胚胎着床和功能性胚胎发育过程中具有重要作用。研究发现，G-CSF 能够通过激活PI3K/AKT 和ERKl/2 信号通路来增强滋养层细胞基质金属蛋白酶-2 活性和血管内皮生长因子分泌，两者均有助于胚胎着床和功能性胚胎的发育[17]。此外，G-CSF 还通过激活P38、ERK1/2 和PI3K 信号通路来调控β1 整合素的表达，这一调控作用导致滋养层细胞中β1 亚基的表达增加，从而增强滋养细胞的增殖、迁移和侵袭能力，减少细胞凋亡的发生，促进胚胎植入和胎盘发育[18-19]。EMT 在维持滋养细胞迁移和侵袭能力方面具有重要作用，Vimentin、E-cadherin 是标志性蛋白，其中Vimentin 蛋白表达水平与滋养细胞迁移和侵袭能力呈正相关，而E-cadherin 则相反。有研究发现，抑制滋养细胞EMT 程序会削弱其迁移和侵袭能力，从而导致RSA 的发生[20]。本研究发现，经DM、DM+滑胎安胎协定方含药血清、G-CSF 分别干预后，滋养细胞中p-AKT、p-ERK1/2、Vimentin 蛋白表达水平均明显升高，其中DM+滑胎安胎协定方含药血清、G-CSF 组滋养细胞E-cadherin 蛋白表达水平均明显降低，提示滑胎安胎协定方通过促进DM 分泌G-CSF 来激活PI3K/AKT/ERK 信号通路和EMT 进程，进而增强滋养细胞增殖、迁移和侵袭能力，帮助胚胎植入和胎盘发育，进而减少RSA 的发生。

综上所述，滑胎安胎协定方可通过促进DM 分泌G-CSF 来激活PI3K/AKT/ERK 信号通路和EMT 进程，进而调控滋养细胞增殖、迁移和侵袭，从而防止RSA的发生。本研究为滑胎安胎协定方在RSA 临床治疗中的应用提供了分子机制的基础。