入侵性害虫桦潜叶蜂生活史及土壤生态适应性*

胡 靓 邢蒙恩 房鸿嫄 刘瀚予 杜志琦 王 楠 孙艳梅 范文忠 冯立超

（1. 吉林农业科技学院 吉林 132101；2. 北华大学 吉林 132013）

桦潜叶蜂（Profenusa thomsoni）最早在古北区英国、日本发现为害白桦（Betulaplatyphylla），随后传播至北美地区，发生大规模为害（Britton, 1924；Ross, 1936）。以幼虫潜食叶肉为害白桦叶片，严重时造成叶片脱落，叶片受害率达90%以上（Benson, 1959）。相关的研究报道，成虫活动受温度和相对湿度影响较大，温度为21 ～ 22 ℃和相对湿度70 %时最适宜产卵，行动活跃（Martin, 1960）。在加拿大及美国阿拉斯加地区，幼虫取食至6 龄后脱叶，在3～12 cm 土层内或落叶层近地表做土茧进入前蛹期（Digweedet al., 2009）。因此，桦潜叶蜂以老熟幼虫脱叶进入树盘周围土壤内做土茧，土壤生境对翌年春季成虫羽化出土具有重大影响。同时，通过对不同区域桦潜叶蜂为害率调查结果表明，在城市中的白桦比城郊村庄及天然林为害率更高（Digweedet al., 1997），这可能是由人类活动及地理隔离等的多重因素所主导，形成城市集中分布模式（Digweedet al., 2004）。同时，文献记载桦潜叶蜂主动扩散能力较弱（Digweedet al ., 1997）。在防控研究中，其中姬蜂科 （Ichneumonidae） 的Lathrolestes thomsoni和Lathrolestes soperi2 种寄生蜂在加拿大等地区可以有效地控制该害虫为害（Andersenet al., 2021），土壤中的寄生性真菌和捕食性线虫对桦潜叶蜂控制较差（Progaret al., 2015）。因此，研究桦潜叶蜂土壤中越冬虫态习性及生态环境因子对其生存的影响，对于入侵性害虫的防控具有重要意义。

目前，对桦潜叶蜂土壤中生活习性相关研究较少，且未见土壤理化性质对其生存影响相关报道。鉴于此，本文研究土中越冬的幼虫与土壤理化性质相关性，探讨土壤越冬桦潜叶蜂对土壤性质的适应性，明确土壤环境因子（含水量、温度、化学性质）对桦潜叶蜂生存及发育的影响。

1 材料与方法

1.1 物种基因鉴定及生物学特性观察

为明确吉林地区入侵的白桦潜叶蜂分类地位，通过形态特征与DNA（COI）序列比对，鉴定物种。采集成虫（孤雌生殖）3 头，用QIAGEN Blood & Tissue 试剂盒 （德国），根据无损法提取DNA（Taekulet al., 2014），保留提取过DNA 的样品作为凭证标本，供形态鉴定。使用徕卡DVM6 体视镜、联用Axiocam 506 color 数码照相系统（德国徕卡显微系统有限公司）对凭证标本拍摄，结果保存于吉林农业科技学院。

获得全基因组DNA 后，采用线粒体基因COI 通用引物（COI-F: 5' -CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3'和COI-R: 5' -TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'）COI 进行PCR 扩增（Simonet al., 1994）。扩增体系为25 µL：PCR Master Mix(2×)12.5 µL，DNA 模板1 µL，上游和下游引物各0.5 µL，最后用ddH2O 补足至25 µL。PCR 扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃后延伸5 min。PCR 产物取5 µL 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，由上海生工生物工程有限公司采用桑格测序法 （Thermo ScientificTMGeneRuleTMr DNA Ladder Mix 测序仪，美国）进行双向测序。获得的原始序列在Geneious 软件中进行拼接并检查是否含终止密码子，排除假基因。对COI 序列与Wei，Taeger，Hari 等所发表的物种基因序列进行比对分析（Weiet al., 2006；Taeger, 2010；Haris,2021）。在MEGA 软件中使用MUSCLE Alignment 算法对序列进行并对，并用邻接法（Neighbor-Joining）构建进化树。

2020 年5—8 月，在实验室内和野外采用对比观察法调查记录虫体生物学特性。实验室内使用恒温培养箱，温度设置为（20 ± 1）℃，相对湿度75%，光周期模拟野外为白昼 : 黑夜 = 12 h∶12 h；在5 个培养箱内分别移入10 组盛有白桦林下原位土壤培养盒（长30 cm×宽20 cm×深15 cm），记录成虫羽化时间。羽化后成虫于养虫笼内使用新鲜白桦叶进行饲养，观察并记录产卵、幼虫生活史等特性。同时，在白桦林内观察记录对比观察野外潜叶蜂为害情况。

1.2 试验设计

选取吉林农业科技学院白桦种植林、吉林市绿化管理处第一苗圃白桦种植林，面积各5 000 m2，2 地相距4.8 km，进行野外调查，试验区远离大型工厂、居民建筑群等。试验保护区宽10 m，采用平行行法于地表设置60 目尼龙网罩，样方长30 cm×宽20 cm×深15 cm（Soperet al., 2015），相邻样点间隔10 m，采样点网罩布置图（图1），每个试验区各设置36 个采样点。

图1 潜叶蜂土壤越冬后成虫羽化定量观察Fig. 1 Quantitative observation of leaf miner adult emergence after overwintering

1.3 不同发育阶段虫量统计

越冬前老熟幼虫及越冬后羽化成虫统计。于采样地点设置面积大小一致的网笼布置于地表，在老熟幼虫集中脱叶阶段，统计网笼内掉落的幼虫数量。入土5 天后，采集网罩样方毗邻区域树盘周围面积大小相同的土壤样品，每样地区域共采集36 个。采用显微镜镜检土壤中幼虫数量，统计越冬前土壤内做土茧幼虫数量。春季越冬后成虫羽化出土阶段，统计网罩采样点处成虫羽化量。每天统计样方网罩内成虫羽化出土数量直至无成虫出土。

1.4 土壤理化性对桦潜叶蜂生存影响

为研究土壤含水量对桦潜叶蜂幼虫化蛹及成虫羽化的影响，于2020 年5 月白桦展叶初期，土壤平均温度为15 ℃左右时设2 个试验区。在吉林农业科技学院设置的样地内采用人工洒水车对白桦进行浇水，间隔3 天浇水1 次，参考吉林市5—6 月年平均降水量，每次浇水6.8 L·m-2，至成虫羽化。每天测定2个样地不同样点土壤15 cm 深处土壤含水量变化。以吉林市绿化管理处第一苗圃白桦样地处理作为对照，不进行浇灌水处理。分别采集2个试验地0～15 cm 的土壤各36 份，每份500 g，待用，采用常规试验方法进行测试。

采用碳氮分析仪Vario MACRO cube 测定土壤全氮（TN）和全碳（TC）（德国Elementar 分析传感系统股份有限公司）；采用ICP-AES 9800 测定土壤总磷（TP）（日本岛津公司）。采用玻璃指示电极法[瑞士梅特勒—托利多国际贸易（上海）有限公司]测定土壤酸碱度（pH）（Spitzeret al., 2011）；土壤含水量（SWC）采用烘干法（105±1） ℃烘干12 h 至恒重（Wilke，2005）；土壤地温计用于检测采样点内土壤温度（ST）。

1.5 数据分析

采用t检验（Holm-Šídák analysis method for multiple comparisons）比较2 分布地白桦林内桦潜叶蜂羽化量差异性，显著性差异水平（P＜0.01）；采用相关性分析方法（correlation analysis）分析桦潜叶蜂土壤内越冬存活量与土壤含水量的相关性关系，同时结合冗余分析RDA（redundancy analysis）分析土壤理化性质对桦潜叶蜂的生存影响，采用蒙特卡洛检验 （Monte Carlo methods）检验对羽化的影响是否显著。

2 结果与分析

2.1 物种鉴定

采用形态学与线粒体DNA 细胞色素氧化酶亚基（COI）基因序列片段对比相结合进行物种鉴定，结果见图2。

图2 桦潜叶蜂相近属系统发育树及成虫鉴定特征Fig. 2 Leaf miner phylogenetic tree and adult identification characteristics

形态特征：雌性，成虫头部黑褐色，触角丝状11 节。前翅第3臀脉与第一臀脉远离；后翅第一缘室和臀室为开室；翅基片为黑色。中胸盾片中叶突具侧毛；第一腹节背板后缘弧形弯曲，亚中部最宽。锯状产卵器，橙黄色—深褐色，具明显的弧形锯齿。卵，初产白色，于叶片表皮内吸水膨胀后呈半透明，大小为0.5 mm；孵化过程颜色逐渐变深，孵化前为棕色。幼虫：初孵幼虫长1 mm。头部棕褐色，三角形；背腹扁平，前突，重度硬化。前胸宽于头部，腹面有一个大的中央和2个侧面的深棕色斑纹。虫体自前胸至腹部逐渐变细，透明可见肠道。中胸和后胸腹侧有小的椭圆形棕色斑纹。胸部和腹部的气门呈棕色，突出。老熟幼虫体呈圆柱形，暗白色，半透明。蛹：化蛹于幼虫分泌物黏贴所形成的土茧内，蛹长4～5 mm，复眼红棕色，头部半透明白色，体躯呈淡黄色。末期逐渐变成蓝灰色，最后变成黑色。

经成虫COI 序列测定，SC855_1基因序列与GenBank 数据库中Profenusa thomsoni序列100%的相似度 (图2)。

生活史及习性：桦潜叶蜂在吉林地区年发生2 代。6 月上旬，始见羽化的成虫，在白桦的下层幼嫩叶片以幼儿虫潜叶危害；6 月下旬至7 月上旬，第一代幼虫大多数幼虫脱叶落入浅土层中，少数于叶片内化蛹，并羽化出成虫，继续危害白桦中、上部嫩叶，8 月下旬至9 月上旬，以老熟幼虫脱叶入土，主要在5～10 cm 做土茧越冬；世代不整齐。观察发现，在干旱年份直至降雨成虫才陆续羽化。

成虫喜树冠下层叶片产卵，卵产于叶片上表皮和栅栏层之间，平均每叶4～6 枚卵，偶有10 枚卵以上。成虫虫口密度大，全部叶片均会被产卵，多虫在同一叶片产卵，但新叶不会被利用。空气相对湿度高于70%，温度20～25 ℃利于成虫产卵。第2代成虫羽化后逐渐向树冠中、上层叶片产卵。卵孵化时间为10 天。幼虫共6 龄；老熟幼虫脱叶后掉落至地表，在土壤缝隙及浅土层中做土茧。

2.2 桦潜叶蜂土壤中不同发育阶段虫量变化

桦潜叶蜂老熟幼虫脱叶入土量、入土后做茧量及成虫羽化量变化见图3。

图3 不同区域桦潜叶蜂幼虫越冬阶段及越冬后虫体存活量Fig. 3 Overwintering stages and post-overwintering survival of P.thomsoni larvae in different regions

通过对冬前土壤中幼虫做茧情况调查表明，越冬前2样地白桦林土壤内平均做茧率分别86.47%和89.26%，在2样地内老熟幼虫做茧量无差异（P＞0.05）；翌年春季浇水处理后，浇水样地（Plot 2）成虫羽化量极显著高于对照样地（Plot 1）羽化量（P＜0.01）(图3)。

2.3 土壤理化性对桦潜叶蜂的影响

试验地人工浇水及对照处理，桦潜叶蜂成虫羽化量对比分析见图4。

图4 土壤含水量及温度与桦潜叶蜂羽化量关系Fig. 4 P. thomsoni eclosion in relation to soil water content and temperature

不同试验区样方的土壤含水量对羽化的影响分析，差异极显著（P＜0.01）（图4a）；成虫羽化量与土壤含水量呈显著正相关关系（P＜0.01,R=0.85）（图4b）。对照样地内土壤含水量低，桦潜叶蜂成虫羽化量受到抑制。土壤pH、氮含量与羽化量正相关（图5a）；人工浇水处理提高了土壤含水量，对成虫羽化具有显著促进作用（P＜0.01），而土壤化学性质对成虫羽化量影响较小（图5b）。

图5 土壤理化性质对桦潜叶蜂羽化作用Fig. 5 Effect of soil physicochemical properties on adults eclosion

3 讨论

3.1 气候因子对桦潜叶蜂分布决定作用

桦潜叶蜂在北美地区每年发生1 代，以孤雌生殖形式完成繁殖（Digweed, 2006）。在吉林地区每年发生2 代，第一代化蛹于叶片上表皮和栅栏层之间，第2代化蛹于土壤内。通过对吉林市区及周边山区、人工林及天然次生林白桦危害情况调查，发现仅在市区内2个区域发生为害，发生面积约为12 hm2，分布范围受限的主要原因是其传播主要途径为人为传播，而主动飞行扩散能力较弱（Digweedet al., 2009；Digweedet al., 2004）。因此，桦潜叶蜂为害发生的主要区域与人类活动频繁或集中性有关。

吉林地区（42°—44°N）冬季平均温度比阿拉斯加和加拿大（54°—71°N）高，土壤内越冬温度对桦潜叶蜂越冬的致死率会降低。适应低温生存的昆虫在高温区生存受到抑制，限制了物种分布区域（Coulsonet al., 1996；Irwinet al., 2000）。因此，桦潜叶蜂在北半球由高纬度向低纬度地区入侵过程中，随着温度升高，其分布区域可能会受限。在本研究中，土壤温度几乎未影响成虫羽化，可能是由于春季土层温度维持在10～15 ℃，此温度区间有利于大多数土壤动物生存（Sulkavaet al., 1996）。在冬季，森林土壤内10 cm 土层内温度在-3 ℃以上（Weigelet al., 2021），由于动物体内代谢及其他生理变化对机体组织的保护，此温度并未对大多数土壤动物构成死亡威胁（Sulkavaet al.,2003）。水分是生物体的必要物质，适宜的土壤含水量是维持土壤动物生存的基本条件；遇干旱胁迫时，绝大多数土壤动物都会改变自身生存状态，通过降低代谢速率等生理活动，进入休眠、滞育等生存状态，以最大程度的适应土壤环境（Danks, 2000；Holmstrup,2014）。春夏交替季节是桦潜叶蜂成虫羽化出土的时间，在本研究中，受降水影响，2020 年5—6 月吉林地区降水量严重减少，土壤表层含水量严重降低，平均含水量不足14%。人工浇水处理区，土壤含水量维持在14.3%～30.8%之间，直接改变了桦潜叶蜂羽化时间，提高羽化量。以上结果表明，温度升高导致水分的加速散失，对冬季生存的节肢动物构成严重威胁（Everattet al., 2015）。因此，土壤含水量在干旱季节决定了桦潜叶蜂对生存选择，土壤含水量是限制虫口密度的关键抑制因子。

3.2 土壤化学性质及生物因子对桦潜叶蜂生存影响

白桦林下土壤其他化学性质几乎不影响桦潜叶蜂越冬幼虫成活率，这可能是由于老熟幼虫脱叶入土做土茧期间分泌黏液类物质，将周围土壤颗粒黏聚于体躯外表形成土茧，而本身并不直接与土壤长期接触，且体壁分泌黏液所形成的保护层直接隔离外部土壤与体躯直接接触（Martin, 1960），因此，对其生存影响较弱。本研究表明，在自然条件下，土壤含水量与桦潜叶蜂的成虫羽化量和羽化时间相关，含水量相对较高的区域羽化量大，羽化时间提前；相反羽化量降低，羽化时间延长。此外，由于土壤内复杂的地下生存环境条件；尽管土壤化学性质如pH、碳、氮、磷等物质对桦潜叶蜂影响较小，但天敌及微生物对进入前蛹的虫体的捕食或寄生作用，也是制约翌年成虫羽化的影响因素之一（Progaret al., 2015；Soperet al., 2019；Schönroggeet al., 1992）。

本研究通过对土壤含水量控制，明确桦潜叶蜂越冬虫态对水分的适应性。在相对可控的土壤环境条件下，通过树盘土壤翻耕，破坏土茧周围土壤水分环境，对削减虫口密度具有一定的作用。对于人为传播等控制措施，加强对土壤、白桦苗木调运等检疫措施，以及合理使用杀虫剂。由于本研究样地处于同一区域并无差异，因此温度对成虫羽化的作用并未体现。桦潜叶蜂在吉林地区首次发现为害白桦，受其研究范围受限，对于桦潜叶蜂的扩散、大面积发生为害等与当地气候、白桦栽培情况、生态环境以及寄生性微生物和天敌等关系研究需进一步开展。

4 结论

桦潜叶蜂是一种入侵性有害生物，主要危害白桦，在吉林地区每年发生2 代，以幼虫在土壤内越冬。土壤理化性质是决定桦潜叶蜂翌年成虫发生量关键影响因素，含水量相对较高的土壤促进了桦潜叶蜂越冬虫态的发育，而相对干旱的土壤抑制成虫羽化，羽化时间延长。