油茶炭疽病复合病菌鉴定及室内药剂评价*

李玲玲 朱原野 张盛培 李 河

（南方人工林病虫害防控国家林草局重点实验室 森林有害生物防控湖南省重点实验室 森林生物资源与有害生物综合管理湖南省普通高等学校重点实验室 中南林业科技大学 长沙 410004）

油茶（Camellia oleifera）是我国特有的木本食用油料树种，主要种植于我国南方14 个省（市、自治区），至今已有两千多年的栽培历史（陈永忠等, 2013）。近年来，我国油茶种植面积持续增加，油茶籽产量不断提高，截至2019 年全国油茶种植面积达到453.3 万hm2，油茶籽产量达267.9 万t。油茶产业的高质量发展对维护我国粮油安全、推动农村经济发展，巩固油茶产区农民脱贫致富成果具有重要作用（张立伟等,2021）。但随着油茶种植面积的迅速增加，各类油茶病害的发生也日趋严重，其中油茶炭疽病是危害油茶最严重的病害之一，严重阻碍了油茶产业的健康发展。目前已报道的油茶炭疽病的病原菌主要有：胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、果生炭疽菌（C.fructicola）、暹罗炭疽菌（C. siamense）、山茶炭疽菌（C.camelliae）、喀斯特炭疽菌（C. karstii）、博宁炭疽菌（C.boninense）、（C. henanense）、哈锐炭疽菌（C. horri,C.nymphaeae）（Liet al., 2018；李河等, 2015；2017；Liet al., 2020）。

复合侵染是指2 种或2 种以上的病原物共同侵染寄主植物引起病害的现象。目前研究表明，在马铃薯（Solanum tuberosum）、蚕豆（Vicia faba）、甜瓜（Cucumis melo）、玉米（Zea mays），番茄（Lycopersicon esculentum）等多种植物中存在由病原物复合侵染引起的病害，Li 等（2021）研究表明，番茄褪绿病毒（ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）复合侵染番茄时具有协同增效作用，导致番茄病害严重度指数高，茎高和茎重降低。钱恒伟等（2017）研究发现甘薯茎枯病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和细极链格孢（Alternaria tenuissima）复合侵染引起的。吴会杰等（2021）研究报道黑点根腐病菌（Monosporascus cannonballus）和镰孢菌（Fusarium oxysporumf.sp.melonis）复合侵染引起甜瓜根腐病。实验室前期研究发现，在分离油茶炭疽病病原菌的过程中，除炭疽属之外，总能分离出拟盘多毛孢属（Pestalotiopsissp.）和链格孢属（Alternariasp.）真菌。进一步致病性测定结果表明，拟盘多毛孢属和链格孢属真菌都是油茶的致病菌。由此笔者推测，油茶炭疽病可能存在炭疽菌和其他致病菌复合侵染现象。

油茶炭疽病的防治措施主要是化学防治。曹志华等（2012）发现10%苯醚甲环唑WG 对油茶炭疽病病原菌的室内毒力最强；陈绍红等（2007）室内和田间试验表明，扑菌清、叶斑净和宝宁对油茶炭疽病的防治效果较好；王义勋等（2014）田间试验结果表明，40%氟硅唑乳油2 000 倍液或10%苯醚甲环唑水分散粒剂4 500 倍液对油茶炭疽病的防治效果较好。但是，一种杀菌剂对不同属甚至同属不同种病原菌的抑制活性存在较大差异，如氟吡菌酰胺对牡丹炭疽病菌的抑制作用较好，但对辣椒炭疽病菌则没有抑制作用（徐娜娜等，2021；高杨杨，2021）；代森锰锌对链格孢（Alternaria alternata）具有抑制作用，但对炭疽病菌（C.gloeosporioides）和新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）几乎没有抑制作用（冯宝珍等，2019；曹志华等，2012；温浩等，2019）。前期研究发现油茶炭疽病斑中除炭疽菌以外，可能还存在其他致病菌，防治多种病菌复合侵染的油茶炭疽病目前尚无相关研究报道，为了有效防治油茶炭疽病，亟需筛选能同时杀死或抑制病斑中多种致病菌的杀菌剂。

本研究采用组织分离法对油茶炭疽病复合病菌进行分离，结合形态学和分子生物学进行种类鉴定，通过复合侵染试验探究致病菌之间的关系，并对致病力强的复合病菌进行室内药剂筛选，以期为全面合理有效的防治油茶炭疽病提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 病样的采集与菌株分离

油茶炭疽病病叶于2020 年6—10 月采集自湖南长沙、浏阳、益阳、湘潭、广西南宁、广东东莞，海南澄迈及江苏南京8 个地区的油茶成林。采用Cai 等（2009）组织分离法分离病原菌，由本实验室保存。

1.2 培养基及供试药剂

供试培养基：PDA 培养基；AEA 培养基。

供试药剂：96%咪鲜胺原药、95%苯醚甲环唑原药、98%啶酰菌胺原药、96%氟吡菌酰胺原药，98%嘧菌酯原药，97%啶氧菌酯原药，均由济南一农化工有限公司提供。99%水杨肟酸（SHAM）为美国Sigma公司产品。

1.3 柯赫氏法则验证

采用李河等（2017）、Maharachchikumbura 等（2016）和Woudenberg 等（2013）的方法对分离获得的油茶病原真菌进行形态学鉴定和柯赫氏法则验证，确定油茶炭疽病斑中的致病菌种类。

1.4 分子生物学分析

采用CTAB 法（Xuet al., 1996）提取致病菌基因组DNA，-20 ℃保存备用。利用通用引物ITS1/ITS4（序列见表1）对所有致病菌的ITS 序列进行PCR 扩增，扩增产物由北京擎科生物科技有限公司进行测序。将获得的序列在NCBI 中进行BLAST 比对，初步分析致病菌种类，进一步用特异性基因扩增测序。炭疽菌属菌株由ITS 和ApMat基因序列联合构建系统发育树进行分析，拟盘多毛孢属、新拟盘多毛孢属及假拟盘多毛孢属菌株由ITS、TUB2和EF-1α 基因联合建树分析，链格孢属菌株由ITS 和Histone-3 基因联合建树分析，所有引物序列和PCR 扩增程序见表1。参考菌株序列在GenBank 数据库中下载。采用CLUSTAL W 进行序列比对分析，用MEGA 7 软件构建N-J(neighbor-joining)系统发育树，自举检验重复1 000 次。

表1 引物序列和PCR 扩增程序Tab. 1 Primer sequence and PCR cycling conditions

1.5 复合侵染试验

将油茶炭疽病斑中分离出的主要复合致病菌作为供试菌株，用打孔器（Φ=4 mm）在生长良好的菌落边缘切取菌饼。参考钱恒伟等（2017）和张永乐等（2018）的方法，采用有伤接种的方式，将菌饼接种在油茶嫩叶和苹果果实上，共设3 个处理，1）先接种炭疽菌属菌，再接同种菌株；2）先单独接种拟盘多毛孢属或新拟盘多毛孢属病菌，再接种同种菌株；3）复合接种，即先接种炭疽菌属病菌，再接种拟盘多毛孢属或新拟盘多毛孢属病菌。待首次接种油茶叶片和苹果果实开始出现病斑后，去除所有接种菌块，再接种同种或不同种真菌，置于28 ℃继续培养2～3 天。每个处理重复6 次，无菌PDA 作为对照。观察叶片和苹果果实发病情况并记录病斑大小。

1.6 杀菌剂毒力测定

采用菌丝生长速率法测定6 种杀菌剂对油茶致病菌的抑菌活性，通过预试验得到供试药剂对不同致病菌的有效浓度范围。啶酰菌胺和氟吡菌酰胺为10、25、50、75、100 µg·mL-1；嘧菌酯和啶氧菌酯为0.005、0.01、0.02、0.04、0.16、5、25，50 µg·mL-1；咪鲜胺为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 µg·mL-1；苯醚甲环唑为0.125、0.25、0.5、1.5、3、4.5 µg·mL-1。从活化3 天的菌落边缘切取菌饼（Φ=4 mm），分别接种到含有咪鲜胺、苯醚甲环唑、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺的PDA 平板，含有嘧菌酯和10、25 µg·mL-1SHAM、啶氧菌酯和10、25 µg·mL-1SHAM 的AEA 平板上，28 ℃培养4 天。分别以含甲醇的PDA 培养基、含甲醇和10、25 µg·mL-1SHAM的AEA 培养基为对照，采用十字交叉法测量菌落直径。

1.7 数据处理

Excel 软件计算菌丝生长抑制率，DPS 软件计算有效抑制中浓度（EC50）。

2 结果与分析

2.1 油茶炭疽病斑中丝状真菌致病性测定及形态特征

采用组织分离法，从油茶炭疽病病叶样本中分离获得186 株丝状真菌，通过回接实验测定它们的致病性，发现这些菌均能引起油茶叶片发病。根据形态特征，可初步将这些菌分为三大类：第一类130 株，在PDA 平板上菌落圆形，边缘整齐，菌丝生长初期为白色绒状，后期转变为灰色或浅褐色。分生孢子长椭圆形或圆柱形，两端钝圆或一端稍尖，单孢，无隔膜，无色；第二类为50 株，PDA 平板上菌落近圆形，白色，后期菌落中央呈浅褐色，由中央向外扩展，有的呈轮纹状，培养后期在PDA 培养基上可以产生黑色油状黏液，即为分生孢子堆。分生孢子为纺锤形或梭形，5 个细胞，有隔膜，顶端和基部细胞颜色浅，多为透明状，中间3 个细胞颜色较深，多为褐色，顶端有2～4 根无色透明的附属丝，基部有1 根短柄；第三类6 株，PDA平板上菌落圆形，中央墨绿色绒状，边缘白色，气生菌丝浓密。分生孢子褐色或黄褐色，棍棒状、倒梨形或卵形，有1～5 个横隔膜，0～3 个纵斜隔膜，多数具有喙。根据菌株的形态特征，初步鉴定第一类为炭疽菌属真菌，第二类为类拟盘多毛孢属真菌，第三类为链格孢属真菌，进一步需要采用分子生物学方法确定。

2.2 分子生物学鉴定

对186 株菌株分别进行不同基因扩增测序，将获得的序列与GenBank 中已知种序列进行比对分析，并下载参考菌株构建N-J 系统发育树。结果表明，130株炭疽菌属菌株聚为6 个分支（图略），占总分离菌株的69.9%，其中56 株以99%的支持率与果生炭疽菌参考菌株聚为1 支，在湖南、海南、广西，广东和江苏采样点均有分布；6 株以99%的支持率与C. aeschynomenes参考菌株聚为1 支，全部采自湖南；40 株以98%的支持率与暹罗炭疽菌参考菌株聚为1 支，采自湖南、海南、广西和广东；9 株以99%的支持率与胶胞炭疽菌参考菌株聚为1 支，采自江苏和湖南两地；14 株以98%的支持率与山茶炭疽菌参考菌株聚为1 支，分布在湖南和广东两地；5 株为未知种Colletotrichumsp.。18 株拟盘多毛孢属菌株，占总分离菌株的9.7%，其中3 株与秤钩风拟盘多毛孢菌（P. diploclisia）参考菌株聚为1 支，1 株与P. humus参考菌株聚为一支，1 株与P. parva参考菌株聚为一支，2 株与玫瑰红拟盘多毛孢(P. rosea)参考菌株聚为一支，11 株为未知种Pestalotiopsissp.；4 株假拟盘多毛孢属菌株聚为2 个分支，占总分离菌株的2.2%，其中1 株以100%的支持率与Pseudo. camelliae-sinensis参考菌株聚为1 支，3株为未知种Pseudopestalotiopsissp.；28 株新拟盘多毛孢属菌株，占总分离菌株的15.6%，其中2 株与Neo.saprophyta参考菌株聚为1 支，3 株与Neo. cubana参考菌株聚为1 支，23 株为未知种Neopestalotiopsissp.。6 株链格孢属菌株聚为3 个分支，占总分离菌株的3.2%，其中2 株以100%的支持率与链格孢参考菌株聚为1 支，1 株与细极链格孢参考菌株聚为一支，3 株未知种Alternariasp.。因此，基于形态学特征和rDNAITS、ApMat、TUB2，EF-1α 和Histone-3基因序列分析，可以确定油茶炭疽病斑中的致病菌有炭疽菌属、拟盘多毛孢属、新拟盘多毛孢属、假拟盘多毛孢属和链格孢属真菌。

2.3 油茶炭疽病同一病斑分离出多种致病菌

对106 个病斑分离出的致病菌种类进行统计分析，结果发现，分离出单一炭疽病菌的病斑55 个，而能同时分离出炭疽病菌和其他致病菌的病斑有51 个，占总分离病斑的48.1%。统计分析发现，油茶炭疽病斑复合致病菌的组合方式有7 种，分为炭疽菌属（同属不同种）真菌；炭疽菌属和拟盘多毛孢属或新拟盘多毛孢属或假拟盘多毛孢属或链格孢属真菌；炭疽菌属，拟盘多毛孢属和新拟盘多毛孢属或链格孢属真菌。其中炭疽菌属和新拟盘多毛孢属，炭疽菌属和拟盘多毛孢属致病菌这2 种组合方式最多，占总复合菌株病斑的41.2%和27.5%（图1），分布在湖南、海南、广西、广东和江苏样品采集地，说明复合菌株共同侵染的现象广泛发生在我国油茶种植区；其次是炭疽菌属（同属不同种），占总复合菌株病斑的15.7%，分布在湖南，广东和海南。试验结果表明，油茶炭疽病中存在炭疽菌属真菌和其它致病菌复合侵染的现象。

图1 病斑分离出的致病菌组合方式Fig. 1 Combination pattern of pathogens isolated from symptomatic diseased tissues

2.4 油茶炭疽病斑中存在复合侵染协同增效现象

根据油茶炭疽病斑中分离出的复合致病菌，将炭疽菌属和拟盘多毛孢属，炭疽菌属和新拟盘多毛孢属，炭疽菌同属不同种这3 种分离率最多的组合方式致病菌回接到油茶上，进行复合侵染试验。研究结果显示，炭疽病菌和拟盘多毛孢属真菌接种油茶叶片5 天，复合接种的叶片发病程度较只接同种炭疽菌的更严重，统计分析表明病斑直径对比组间存在显著差异（图2A，2B，2C）；炭疽病菌和新拟盘多毛孢属真菌复合接种的病斑显著大于只接同种炭疽菌（图2D，2E，2F）；不同种炭疽菌复合接种的病斑大小与只接同种炭疽病菌差异不显著。试验结果表明，油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌复合侵染协同增效现象。为探究在其他寄主植物上是否也存在类似的现象，笔者在苹果果实上进行了复合侵染试验。试验结果显示，炭疽病菌和新拟盘多毛孢属真菌先后复合接种的病斑大于只接同种炭疽菌的病斑，统计分析差异显著（图2G，2H），说明在其他寄主植物中也存在炭疽属真菌和其它致病菌复合侵染现象。研究结果表明，油茶炭疽病斑中的炭疽菌属、拟盘多毛孢属和新拟盘多毛孢属真菌之间存在复合侵染协同增效现象。

图2 油茶叶片和苹果复合接种致病力测定Fig. 2 Symptoms of oil-tea leaves and apples after compound inoculation of pathogens

2.5 不同杀菌剂对油茶炭疽病复合病菌的抑制作用存在差异

6 种杀菌剂对油茶炭疽病致病菌的室内毒力测定结果显示，啶酰菌胺和氟吡菌酰胺对炭疽菌属和新拟盘多毛孢属致病菌几乎没有抑制作用，在50 µg·mL-1供试浓度下，菌丝生长抑制率在12.7%～43.3%之间（表2）。咪鲜胺和苯醚甲环唑对炭疽菌属、拟盘多毛孢和新拟盘多毛孢属致病菌均具有很强的抑制作用，EC50在0.011～0.555 µg·mL-1之间（表3）。嘧菌酯和啶氧菌酯对拟盘多毛孢属和新拟盘多毛孢属真菌具有一定的抑制作用，EC50在0.007～0.020 µg·mL-1之间，但这2 种杀菌剂在50 µg·mL-1供试浓度下对炭疽菌的抑制作用较差。且同一杀菌剂对不同炭疽菌的抑制作用存在差异，嘧菌酯和啶氧菌酯对山茶炭疽菌C.camelliae的抑制作用强于果生炭疽菌C. fructicola、暹罗炭疽菌C. siamense 和胶胞炭疽菌C. gloeosporioides，这表明山茶炭疽菌对这两种杀菌剂更为敏感。试验结果表明，在供试的6 种杀菌剂中，咪鲜胺和苯醚甲环唑对油茶炭疽病复合病菌的毒力较强，其次是嘧菌酯和啶氧菌酯，而啶酰菌胺和氟吡菌酰胺对复合病菌几乎没有抑制作用。

表3 4 种杀菌剂对油茶炭疽病菌的室内毒力测定①Tab. 3 Toxicity test of four fungicides against pathogens of Camellia oleifera

3 讨论

3.1 油茶炭疽病菌的种类与分布

本研究分离获得186 株致病菌，其中130 株为炭疽菌，56 株为果生炭疽菌，分离率最高，其次是暹罗炭疽菌、山茶炭疽菌和胶胞炭疽菌，这与李河等报道的果生炭疽菌是油茶炭疽病的优势致病菌的结果一致（李河等，2014；2017；Li, 2019）。在样本采集地湖南、海南、广西，广东和江苏等地均发现存在果生炭疽菌，说明这类病原菌分布范围广，环境适应能力强，这与李河等（2014）报道的结果一致。除果生炭疽菌以外，江苏省只分离出胶胞炭疽菌，广西省和海南省只分离出暹罗炭疽菌，14 株山茶炭疽菌中13 株来自于广东省，这是否与病原菌种类的分布存在地理区域差异有关，有待进一步研究。

3.2 植物病害中存在病原菌复合侵染现象

目前关于由多种病毒复合侵染引起植物病害的报道较多，如番茄褪绿病毒ToCV 和番茄黄化曲叶病毒TYLCV 复合侵染番茄植株，且影响与寄主和昆虫媒介的互作（Ontiveroset al., 2021）。赵丽玲等（2020）报道了中国南瓜曲叶病毒SLCCNV 和野茼蒿黄脉病毒CraYVV 复合侵染引起水茄发病，并发现在CraYVV 发生区域，病毒SLCCNV 与CraYVV 存在协同作用。在真菌引起的植物病害中也存在复合侵染现象。张永乐等（2018）对山东省茶褐枯病病原菌进行了研究，结果发现该病害是由围小丛壳菌山茶专化型（Glomerella cingulatef. sp.camelliae）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）复合侵染引起的。钱恒伟等（2017）对青岛市甘薯茎枯病的病原菌尖孢镰刀菌和细极链格孢进行了致病力研究，结果表明，这2 种病原菌均可引起甘薯茎枯病，且病原菌混合接种较单独接种的发病率高，致病力强。李培琴等（2021）研究表明互隔交链孢（Alternaria alternata）和芍药生拟盘多毛孢（Pestalotiopsis paeoniicola）既可单独侵染也可复合侵染引起皇帝陵侧柏叶枯病，且二者病原菌复合侵染比单独接种时的发病率高，发病程度也更为严重。本研究对油茶炭疽菌属、拟盘多毛孢属和新拟盘多毛孢属致病菌进行复合侵染试验，结果发现，存在炭疽病菌和其他致病菌复合接种较先后均接种炭疽病菌的致病力强，发病程度更严重，这与李培琴等报道的Alternaria alternata和Pestalotiopsis paeoniicola复合侵染引起黄帝陵侧柏叶枯病更严重的结果一致，表明油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌复合侵染协同增效现象，这些病原在复合侵染过程中可能存在一定的互作，但具体的作用机制仍需进一步研究。苹果复合侵染试验结果进一步验证，炭疽病菌、拟盘多毛孢属和新拟盘多毛孢属致病菌之间极可能存在协同作用，在其它寄主植物内可能也存在炭疽病菌和其他致病菌复合侵染现象。

3.3 杀菌剂种类与病原菌抑菌效果的关系

甲氧基丙烯酸酯（QoI）类、琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）类及甾醇脱甲基抑制剂(DMI)类杀菌剂是目前使用最多的三类杀菌剂，具有抗菌谱广，活性高等特点（严明，2016）。DMI 类杀菌剂被广泛应用于炭疽病的防治。徐从英等（2021）报道了咪鲜胺对橡胶树炭疽病菌C. siamense的抑制活性最好。刘霞等（2013）研究发现咪鲜胺、戊唑醇和三唑酮对核桃炭疽病菌C.gloeosporioides的防治效果较好。本研究结果表明，咪鲜胺和苯醚甲环唑对油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）均具有较强的抑制作用，同时这两种杀菌剂对油茶拟盘多毛孢和新拟盘多毛孢致病菌也具有较强的室内毒力。由于DMI 类杀菌剂作用位点单一，容易产生抗性，后续可考虑与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂复配使用。QoI 类和SDHI 类杀菌剂均为线粒体呼吸抑制剂，通过阻碍电子传递，影响细胞能量的合成和供给，从而抑制菌丝生长。徐娜娜等（2021）研究表明氟吡菌酰胺和啶氧菌酯对牡丹炭疽病菌C. gloeosporioides的抑制活性较强，EC50值分别为0.013 8 µg·mL-1和0.032 4 µg·mL-1。这与高杨杨（2021）报道的辣椒炭疽菌（C. gloeosporioides、C. fructicola等）对氟吡菌酰胺和啶酰菌胺表现天然不敏感的结果不一致。本试验结果发现氟吡菌酰胺和啶氧菌酯对油茶炭疽病菌（C. fructicola、C. siamense、C. camelliae，C. gloeosporioides）的抑制活性较弱，表明不同寄主植物的同种病原菌对杀菌剂的敏感性具有差异性。

本试验测定了6 种杀菌剂对油茶炭疽菌属、拟盘多毛孢属和新拟盘多毛孢属致病菌菌丝生长的抑制作用，研究结果为油茶炭疽病的防治提供参考，但本试验工作均在实验室内完成，环境条件较为稳定，而田间施药会受到多种因素如温度、降雨等因子影响，药剂的防治效果可能会有差异，因此本试验结果还需田间试验验证。

4 结论

对湖南、海南、广西，广东和江苏5 地油茶成林叶部炭疽病斑的致病菌进行分离鉴定，发现油茶炭疽病同一病斑能分离出多种致病菌，并发现油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌和其他致病菌复合侵染协同增效现象；进一步对油茶炭疽病斑中多种致病菌进行防治药剂筛选，结果表明咪鲜胺和苯醚甲环唑的抑菌效果最好，可作为防治油茶炭疽病的首选杀菌剂。