GC-MS/MS 法测定药品中N-亚硝胺类化合物的含量★

王明明，彭雪琦，葛晓晓，庄件兵，张维祥

（江苏省生产力促进中心，江苏 南京 210000）

0 引言

从2018 年7 月开始，FDA 宣布召回缬沙坦，因为这种药物中含有N-亚硝基二甲胺（NDMA）。对所有制造商的血管紧张素受体阻滞剂（ARB）类活性药物成分（API）和成品药的后续调查也导致了缬沙坦、厄贝沙坦和氯沙坦被额外召回。已发现这些药品中含有NDMA 和N-亚硝基二乙胺（NDEA），两者均为已知动物致癌物和疑似人类致癌物。随后，N-亚硝基异丙胺（NEIPA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）、N-亚硝基二丁胺（NDBA）和N-亚硝基甲基-4-氨基丁酸（NMBA）等其他杂质均被标记为潜在的亚硝胺杂质。迄今为止，1 100 多个不同批次的沙坦类药物（缬沙坦、氯沙坦和厄贝沙坦）已被召回，因为其中所含的这些杂质已超过了临时限值[1]。

1 亚硝胺类杂质的来源

在药品的生产过程中，在特定工艺条件下，使用到某些起始物料、原料和中间体，在API 生产过程中可能会形成亚硝胺杂质。这些亚硝胺杂质在后续的API 生产工艺步骤中可能无法全部清除。

胺类物质和亚硝酸盐的反应。使用亚硝酸钠（NaNO2），或其他亚硝酸盐，当存在仲胺或叔胺时，可能会形成亚硝胺物质。仲胺可能会在试剂和溶剂中以杂质或降解物出现。它们可能是试剂、溶剂、API、其降解产物和前体结构的一部分[2]。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪；Agilent7890B-7000D 气质联用仪，安捷伦；聚乙二醇石英毛细管柱HP-INNOWAX，色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；旋涡混匀仪WH-3，上海沪西分析仪器厂有限公司；分析天平，BSA224S-CW，赛多利斯；飞鸽牌台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；超纯水，色谱纯乙腈，Honeywell 公司；色谱纯甲醇，Honeywell 公司；N-亚硝基二乙胺（NDEA）标准品，100μg/mL，DR 公司；N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIA）标准品，质量浓度均为100 μg/mL，ANPEL 公司；奥美沙坦酯片，20 mg/片，北京福元医药公司。

2.2 实验方法

2.2.1 色谱条件

毛细管柱：HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm，0.25 μm；检测器：安捷伦7000D；进样口温度：250 ℃；检测器温度：280 ℃；模式：不分流；恒流模式，流量：1 mL/min；载气：He；进样量：2 μL；柱箱温度：起始温度40 ℃，维持0.5 min，再以20 ℃/min 的速率升温至200 ℃，再以60 ℃/min 的速率升温至250 ℃，维持15 min。

2.2.2 质谱条件

电子轰击（EI）离子源；电离电压70 eV；离子源温度280 ℃；四极杆温度Q1和Q2为150 ℃。采用选择离子监测模式定量分析；碰撞气体流速：氮气，1.5 mL/min；猝灭气体流速：氦气，4 mL/min 溶剂延迟3 min。

3 种亚硝胺类物质特征离子参数为N-亚硝基二乙 胺（NDEA）（102，85，56）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）（74，44，42）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）（130，88，42）。

2.3 样品前处理

2.3.1 供试品溶液

精密称取0.5 g 奥美沙坦片样品并转移到10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释定容，超声15 min，取出摇匀。将溶液转移至10 mL 离心管中，放入离心机，以4 000 r/min 的转速离心2.5 min，取适量上清液过0.45 μm 尼龙过滤器过滤，转移至GC 样品瓶中待分析。

2.3.2 储备溶液（10 μg/mL）

精密移取质量浓度均为100 μg/mL 的N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）各1mL 于3 个不同的10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为10 μg/mL 的各标准储备液。

2.3.3 混合标准中间液（1 μg/mL）

分别移取N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）的储备液各1 mL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为1 μg/mL 的混合标准中间液。

2.3.4 标准曲线溶液

用甲醇逐级稀释该混合标准中间液，配制质量浓度为1.25、2.5、5、10、20、40、80、100 μg/L 标准曲线溶液。

3 结果与讨论

3.1 提取试剂的选择

比较了乙腈和甲醇的提取效果，两者回收率均达到了95%以上。但是用乙腈作为提取试剂时会有明显的杂质峰（见图1），而用甲醇提取则没有（见图2）。因此选择甲醇作为提取试剂。

图1 乙腈作为提取试剂的加标回收图

图2 甲醇作为提取试剂的加标回收图

3.2 专属性试验

建立的色谱/质谱分析方法能够准确定量各潜在杂质，杂质与杂质之间、杂质与主峰、杂质与溶剂之间不存在相互干扰。

3.2.1 空白溶液

取空白溶液（10 mL 甲醇）、NDMA、NDEA、NDIPA混合标准溶液、奥美沙坦供试品溶液各进一针，确保各潜在杂质，杂质与杂质之间、杂质与主峰、杂质与溶剂之间不存在相互干扰。

3.2.2 验证结果（表1）

表1 3 种化合物保留时间 单位：min

溶剂空白，奥美沙坦供试品溶液在NDEA，NDMA，NDIPA 色谱峰位置无干扰色谱峰，该分析方法专属性良好。

3.3 线性范围和检出限及定量限

在上述色谱质谱条件下，分别取2 μL N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）混合标准系列溶液进行分析，以待测物色谱峰面积和对应其质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。以3 倍信噪比确定方法的检出限，以10 倍信噪比确定方法的定量限，相应结果见表2。

表2 线性参数和检出限及定量限

3.4 加标回收率与精密度测试

在上述气质色谱条件下，按本方法对一种降压药奥美沙坦片进行提取分析，实验结果表明该药品中未检出N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）。在该样品中加入不同浓度的3 种亚硝胺类标准品，加标量分别为为20 ng、200 ng，每个浓度平行测定6 次，考察方法的加标回收率和精密度，结果见表3。

表3 加标回收率与精密度结果

由表3 可见，N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）的平行加标回收率为91.5%～114.6%，相对标准偏差为0.975%～3.02%（n=6），满足分析测试要求。

3.5 溶液稳定性

配制质量浓度为20 ng/mL 杂质限度浓度的奥美沙坦溶液作为溶液稳定性测试溶液。在室温下，分别于0、15、18、23、43 h 进样分析，统计3 种化合物的峰面积，RSD 应小于10%。验证结果见表4。

表4 三种化合物不同时间进样分析的峰面积和RSD 值

不同时间点供试品溶液的N-亚硝基二甲胺（NDMA）峰面积的RSD 为5.78%，N-亚硝基二乙胺（NDEA）峰面积的RSD 为6.67%，N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）峰面积的RSD 为4.22%，均小于10%，符合要求。

3.6 耐用性

改变色谱条件，配制加标质量浓度为20 ng/mL的供试品溶液，改动条件下的3 种化合物色谱峰面积与原条件下的峰面积比值均应在80%～120%。

标准条件：见2.2 色谱条件。

1）柱箱温度：起始温度38 ℃，维持0.5 min，再以20 ℃/min 的速率升温至200 ℃，再以60 ℃/min 的速率升温至250 ℃，维持15 min。

2）柱箱温度：起始温度42 ℃，维持0.5 min，再以20 ℃/min 的速率升温至200 ℃，再以60 ℃/min 的速率升温至250 ℃，维持15 min。

3）进样口温度：248 ℃。

4）进样口温度：252 ℃。

验证结果见表5。

表5 3 种化合物不同条件下进样分析的峰面积和比值

条件变动后测试结果与原条件测试结果相比，NDMA 峰面积的比值在104.05%～105.23%之间，NDEA 峰面的比值在102.02%～104.23%，NDIPA 峰面的比值在101.31%～102.64%，符合要求。

4 结论

本文建立气相色谱质谱法测定药品中N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）3 种亚硝胺类化合物含量的分析方法。本实验对方法的提取试剂进行了确定，考察了方法的线性、检出限等参数。实验结果表明，本方法操作步骤简单，检出限低，加标回收率和精密度满足分析测试要求，适用于N-亚硝基二乙胺（NDEA）、N-亚硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二异丙胺（NDIPA）3 种亚硝胺类化合物含量的分析。