肿瘤出芽及肿瘤浸润淋巴细胞对食管鳞状细胞癌淋巴结转移的预测价值研究

张继方，陈芳，唐佳雯，李红亮

食管癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，中国为食管癌高发国家，发病和死亡人数分别占全球的53.7%和55.3%［1-2］。淋巴结转移状态和转移的数量直接决定食管癌N 分期以及患者进一步的治疗方案，是影响预后的关键因素［3-4］。然而食管黏膜下淋巴管网丰富，引流通路复杂广泛，涉及颈、胸、腹部等20 余组淋巴结［5］，当早期肿瘤突破黏膜固有层时即可发生淋巴结转移，具有区域性、双向性、连续性、跳跃性等特点［6］。因此，明确食管癌淋巴结转移的危险因素，寻找能够预测淋巴结转移的方法具有参考意义。

按照组织学类型，我国以食管鳞状细胞癌（ESCC）较为常见，而西方国家以食管腺癌多见［7］。虽然现今分子病理学与免疫治疗发展迅速，但肿瘤组织形态学仍是病理诊断的重要基石。肿瘤出芽（TB）是可在多种恶性肿瘤中观察到的病理组织形态学现象，反映了肿瘤具有较强的侵袭或转移能力［8-10］，并提示与早期的结直肠癌、食管癌及胃癌等发生淋巴结转移具有相关性［11-13］。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是存在于肿瘤免疫微环境中具有抗肿瘤作用的淋巴细胞群，发挥免疫应答作用［14］。有证据支持TILs 可用于预测恶性肿瘤患者免疫治疗的疗效并提示预后［15-17］，有研究提示其在早期胃癌中是淋巴结转移的预测因子［18］。本研究主要分析TB 和TILs 与ESCC 临床病理特征的相关性，并评估两者对食管癌淋巴结转移的预测价值，旨在从病理组织形态学方面寻找提示临床治疗的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2013 年1 月—2022 年3 月于宁波大学附属人民医院行食管癌根治切除并留存石蜡标本的124例ESCC 患者为研究对象。患者年龄46～82 岁，中位年龄62 岁。纳入标准：（1）病理诊断证实为ESCC；（2）有完整的临床病例资料，包括患者性别、年龄、肿瘤长径、肿瘤分化程度、肿瘤浸润层次、有无淋巴结转移、有无脉管内癌栓；（3）术前未行新辅助治疗。排除标准：（1）同时患有其他部位原发肿瘤的患者；（2）既往因其他疾病接受胸或腹部大手术的患者。本研究已通过宁波大学附属人民医院伦理委员会批准，伦理审批号为（2021）年伦理审查（科研）第（055）号。

1.2 免疫组化染色 制备切片，厚度约4 μm，二甲苯脱蜡，梯度酒精乙醇（100%、95%、75%）水化，高压锅高温抗原修复5 min（pH 6.0 柠檬酸盐修复液），运用全自动免疫组织化学染色仪（德国LEICA，LEICA BOND MAX）染色，具体步骤按照仪器操作说明书执行。

1.3 判读TB TB 是在显微镜下观察到的上皮-间充质转化（EMT）的病理形态学表现［19］，目前食管癌中TB尚无规范化的评估方法，本研究参考2016 国际TB 共识会议（ITBCC）推荐的结直肠癌TB 评估方法［20］，选择TB 最密集的区域，即“热点区”计数（×20 视野，即0.785 mm2区域），计数显微镜下所见的肿瘤浸润前沿间质内散在的呈未分化形态的肿瘤细胞群，细胞群为单个肿瘤细胞或<5 个细胞的肿瘤细胞簇。根据标准将其分为低、中、高级别，出芽数分别为0～4、5～9、≥10个。本研究通过细胞角蛋白5/6（CK5/6）免疫组化染色判读TB 个数，依据上述推荐的TB 评估方法，124 例患者的苏木素-伊红染色（HE）切片及CK5/6 染色的TB由两名病理医师阅片综合评估并讨论确定TB 分级［13］。本研究将TB 分级中的低级别和中级别合并为低-中级别TB，与高级别TB 行进一步的对比分析。

1.4 判读TILs 本研究采用2014 年国际肿瘤浸润淋巴细胞工作组推荐的乳腺癌中TILs 的评估标准［21］进行食管癌TILs 形态学评估，TILs 为单核淋巴细胞总面积占肿瘤间质总面积的百分比，并在侵袭性肿瘤的边界内全面评估肿瘤区域的平均TILs，而不能仅关注热点区域，一般四舍五入到最接近的5%或10%。本研究由两名病理医师共同阅片评估HE 切片中的TILs，TILs<30%为低密度TILs，TILs ≥30%为高密度TILs［22］。

1.5 分期 本研究参照美国癌症联合会与国际抗癌联盟联合发布的第八版食管癌分期系统［23］，对食管癌患者进行病理TNM（pTNM）分期。

1.6 统计学方法 所有数据资料应用SPSS 27.0 统计软件进行统计学分析，符合正态分布计量资料以（±s）表示，组间比较采用两独立样本t 检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验或Fisher's确切概率法；采用多因素Logistic 回归分析探究ESCC 患者淋巴结转移的影响因素，并采用受试者工作特征（ROC）曲线探讨TB 和TILs 对ESCC 患者淋巴结转移的预测价值。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCC 的TB 数目与分级 镜下观察肿瘤浸润前沿间质内单个孤立的癌细胞或小癌细胞簇。应用免疫组化CK5/6 进行染色，CK5/6 在患者中均呈强阳性表达，着色于细胞膜，参考CK5/6 染色进行TB 分级，见图1。

图1 ESCC 患者TB 的HE 和CK5/6 染色结果（×200）Figure 1 Haematoxylin-eosin and CK5/6 immunohistochemical staining results of TB in patients with ESCC

2.2 有无淋巴结转移ESCC 患者临床病理特征的比较有淋巴结转移者60 例（48.4%），无淋巴结转移者64例（51.6%），有无淋巴结转移者肿瘤长径、肿瘤分化程度、肿瘤浸润层次、脉管内癌栓、TB 分级、TILs 密度比较，差异有统计学意义（P<0.05）。按病理特征将患者分为低-中级别TB+高密度TILs 者（n=40）、高级别TB+高密度TILs 者（n=17）、低-中级别TB+低密度TILs 者（n=34）、高级别TB+低密度TILs 者（n=33）（图2），有无淋巴结转移者TB 分级+TILs 密度比较，差异有统计学意义（P<0.05）。有无淋巴结转移者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 有无淋巴结转移ESCC 患者临床病理特征的比较〔例（%）〕Table 1 Comparison of clinicopathological features between ESCC patients with and without lymph node metastasis

图2 ESCC 患者TB 和TILs 的HE 染色（×200）Figure 2 Haematoxylin-eosin staining results of TB and TILs in ESCC patients

2.3 淋巴结转移与ESCC 患者临床病理特征的多因素Logistic 回归分析 以是否存在淋巴结转移为因变量（赋值：无=0；有=1），以肿瘤长径（赋值：肿瘤长径≤2.5 cm=0；肿瘤长径>2.5 cm=1）、肿瘤分化程度（赋值：肿瘤高-中分化=0；肿瘤低分化=1）、肿瘤浸润层次（赋值：pT1 期=0；pT2+pT3 期=1）、TB 分级（赋值：低-中级别TB=0；高级别TB=1）、有无脉管内癌栓（赋值：无=0；有=1）及TILs 密度（赋值：低密度TILs=0；高密度TILs=1）为自变量，进行多因素Logistic 回归分析，结果显示：TB 分级（OR=20.078）、脉管内癌栓（OR=28.609）、TILs 密度（OR=0.218）是ESCC患者出现淋巴结转移的影响因素（P<0.05），见表2。

表2 ESCC 患者出现淋巴结转移影响因素的多因素Logistic 回归分析Table 2 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of lymph node metastasis in ESCC patients

2.4 TB 与TILs 预测ESCC 患者淋巴结转移的价值 采用ROC 曲线评估TB 与TILs 预测ESCC 患者淋巴结转移的价值，结果显示，TB 预测ESCC 患者淋巴结转移的ROC 曲线下面积（AUC）为0.835〔95%CI（0.763，0.907），P<0.001〕，灵敏度为0.700，特异度为0.859；TILs 预测ESCC 患者淋巴结转移AUC 为0.656〔95%CI（0.558，0.753），P<0.001〕，灵敏度为0.700，特异度为0.609。表明TB 分级与TILs 密度预测ESCC 患者淋巴结转移的诊断效能良好（图3）。

图3 TB 与TILs 预测ESCC 患者淋巴结转移的ROC 曲线Figure 3 ROC curves of TB and TILs for predicting lymph node metastasis of ESCC

3 讨论

TB 最初在结直肠癌中被深入研究。一项纳入806例pT1 期结直肠癌的回顾性多研究中心结果提示，浸润深度<1 000 μm 的203 例患者中有4 例（2%）发生淋巴结转移，低于浸润深度≥1 000 μm 的淋巴结转移率；高级别TB 病例发生淋巴结转移的比例（25%）高于低级别TB（7%）（P<0.001）；黏膜下浸润深度≥1 000 μm、高级别TB 是pT1 期结直肠癌淋巴结转移的独立危险因素［24］。在进展期结直肠癌，仍有相关研究证实，高级别TB 是提示肿瘤淋巴结转移的重要组织学特征［25］。一项纳入12 项研究包含1 652 例患者的系统评价表明，高级别TB 与pT2 期结直肠癌患者更短的5 年生存率相关［26］。由于TB 对结直肠癌侵袭转移及预后的重要价值，已将TB 作为结直肠癌常规病理报告内容。

目前尚未将TB 作为ESCC 病理报告的常规内容。本研究结果提示高级别TB 淋巴结转移率为68.3%，高于 低- 中 级别TB 淋 巴结 转 移率（31.7%）。FUCHINOUE 等［13］分析了50 例浅表ESCC 患者，结果证实TB 分级和浅表ESCC 的淋巴结转移相关，本研究结果与之一致，高级别TB 病例具有更高的淋巴结转移率。在临床治疗中，对于早期内镜下黏膜剥离术（ESD）及食管癌根治切除患者，均建议在病理报告中加入TB分级。若存在高级别TB，早期ESD 患者建议仍要采取积极的治疗手段，如追加手术或放化疗。

在恶性黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌等多个系统恶性肿瘤中均有研究证实TILs 与预后情况相关［27］，在TILs 与淋巴结转移的研究中，有结果提出TILs 与早期胃癌的淋巴结转移相关，低密度TILs 是淋巴结转移的独立预测因素［18］。本研究表明，TILs 与ESCC 淋巴结转移具有相关性，并且多因素分析结果显示，TB、TILs 及脉管内癌栓是ESCC 淋巴结转移的影响因素。

本研究将患者分为低-中级别TB+高密度TILs 者、高级别TB+高密度TILs 者、低-中级别TB+低密度TILs 者、高级别TB+低密度TILs 者。结果显示，低-中级别TB+高密度TILs 者淋巴结转移率较低，高级别TB+低密度TILs 者淋巴结转移率较高。通过ROC 曲线进一步得出，TB 分级与TILs 密度预测ESCC 患者淋巴结转移的诊断效能良好，该结果应用于临床，有助于指导患者的后续治疗，改善预后情况。

本研究存在一定的局限性，本研究为单中心回顾性研究且规模有限，由于失访人数较多，未分析TB 分级与TILs 密度对预后的影响，后期研究将进一步完善。

综上所述，TB、TILs 与ESCC 患者淋巴结转移密切相关，并具有较好的预测价值，对行ESD 切除的早期ESCC 患者以及已接受根治切除术但淋巴结清扫不足患者的后续治疗方案具有一定临床指导意义。

作者贡献：张继方提出主要研究目标，负责研究的构思与设计，研究的实施，统计学处理，图、表的绘制与展示，撰写论文；唐佳雯进行数据的收集与整理；张继方、陈芳负责病理形态学评估，进行论文的修订；李红亮负责文章的质量控制与审查，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。