单核细胞增生李斯特菌定量质控样品的制备及定值的不确定度评价

◎ 刘锦鹤

（沈阳市食品药品检验所，辽宁 沈阳 110136）

李斯特菌属的细菌为革兰氏阳性小杆菌，依据其生化特性可分为8个菌种，包括单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下简称单增李斯特菌）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特菌（L. seeliger）等。其中单增李斯特菌因其细胞的苯酚-水浸出物可以诱导单核细胞的生成而获得了“单核增生细菌”这个种名[1]。单增李斯特菌感染中枢神经系统，对人和动物均具有很强的致病性，其他的李斯特菌或者只是感染动物，或者只是腐生细菌[2]。

近年来，美国和加拿大等国曾多次暴发由单增李斯特菌导致的食品安全事件。据美国疾病控制与预防中心统计，相比沙门氏菌0.5%、诺如病毒小于0.1%、弯曲杆菌0.1%的死亡率，由单增李斯特菌引起的食物中毒事件死亡率高达15.9%。人类感染后轻症一般为流感样症状，中重度症状则表现为胃肠炎、脑膜炎、流产等。孕妇、婴儿、60岁以上老人及免疫力低下者更易感染单增李斯特菌。因此，在食品安全检测实验室准确检出食品中污染的单增李斯特菌尤为重要。在国内微生物领域相关标准物质极其匮乏的情况下，本研究制备了单增李斯特菌的定量标准质量监控样品，通过应用其进行实验室内部或实验室间的质量控制活动，以保证单增李斯特菌定量检测结果的准确和可靠。

在特征关联图中，特征信息Fi是顶点的集合，Ri表示顶点之间关系的集合，＜fia,fib＞表示fia,fib两个特征信息节点之间存在一条关系弧e，若＜fia,fib＞∈Ri则＜fib,fia＞∈Ri且 fib≠fia，谓词p(fia,fib)定义＜fia,fib＞的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

单增李斯特菌ATCC19115、伊氏李斯特菌CICC21663、斯氏李斯特菌CICC21671、英诺克李斯特菌ATCC33090，中国工业微生物菌种保藏管理中心；TSB-YE、TSA-YE、李氏增菌肉汤LB1、LB2，糖发酵管，北京陆桥；Listeria显色培养基，法国科玛嘉；脱脂奶粉，上海生工生物；海藻糖，国药集团；麦芽糊精，上海麦克林；乳糖，北京奥博星；GP细菌鉴定卡，梅里埃公司。

1.2 仪器与设备

Pilot5-8ES冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；LBI-150生化培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机，Eppendorf公司；MLS-3780压力蒸汽灭菌器，Sanyo公司；麦氏比浊仪，Vitek 2 Compact全自动微生物生化鉴定系统，梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.5 质量监控样品特性量值的定值

将瓷珠冷冻保存的单增李斯特菌、伊氏李斯特菌、斯氏李斯特菌、英诺克李斯特菌4种菌株接种至TSB-YE液体培养基，30 ℃培养18～24 h，取菌液划线接种到TSA-YE琼脂培养基斜面，同时接种至李斯特菌显色培养基，36 ℃培养18～24 h。分别随机挑取李斯特菌显色培养基上菌落进行革兰氏染色后在显微镜观察，并通过接种木糖、鼠李糖发酵管、生化鉴定及溶血试验确定4种李斯特菌菌株的纯度及活力[3]。

按1.3.5中定值方法，计算单增李斯特菌平板计数方法定量检测结果的平均值作为定值结果（表4），单增李斯特菌定值结果平均值为4 357 CFU·mL-1，相对标准偏差为9.84%。

本次质控样品的制备是参考前人[5-11]研究的保护剂配方，通过试验最终选定脱脂奶粉、乳糖、海藻糖、麦芽糊精作为菌种复方冷冻干燥保护剂。保护剂材料使用前按照一定比例用生理盐水稀释，经115 ℃高压灭菌15 min。冷冻干燥机及相关使用的配件需在使用前消毒灭菌。

冻干过程主要包括预冻结、初级干燥以及二级干燥等3个阶段。冻干过程中温度持续降低和水分升华而形成的冰晶会对细胞膜造成不可逆的损伤，菌种存活率在冻干过程中会受到很大的影响。因此，冻干的过程中在菌液中加入一定配比的保护剂是有效提高菌种冻干存活率的方法[4]。

单增李斯特菌质量监控样品定值结果总的不确定度由两部分组成。第一部分是测量影响因素引起，以非统计分析方法评定出的A类不确定度uA，其主要来源包括吸管的不确定度、溶液稀释的不确定度、加样体积的不确定度等；第二部分是重复检测引起的不确定度uB，主要是检测过程中多种因素作用下，随机性造成各次检测单增李斯特菌菌数不同引起的，以计数菌量的对数值求不确定度。将两部分不确定度合成构成定值的合成不确定度u，扩展不确定度U=ku（k=2，置信概率95%）。

但是，有关乳酸菌固态发酵仔猪配合饲料的研究鲜有报道。本课题组结合固态发酵饲料的产业化实际情况，在科学设计试验方案的基础上系统地研究乳酸菌固态发酵仔猪配合饲料生产技术，本研究主要集中在发酵的工艺参数对发酵产品主要营养指标（蛋白质）的影响及工艺参数的优化，为乳酸菌固态发酵仔猪配合饲料的实际生产提供理论依据。

1.3.3 质量监控样品均匀性检验

吸取1 mL样品稀释液分别以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL加入3个李斯特菌显示培养基平板中，使用1 mL流出式分度移液管，则加样产生的不确定度为

1.3.4 质量监控样品稳定性考察

质量监控样品冻干后，考虑到残留的水分在冷冻状态下形成的冰晶可能对样品中的活菌造成二次损伤，所以置于冷藏条件下（4 ℃）进行保存，同时对该温度下保存的样品进行稳定性试验，分别于第3天、第15天、第30天随机抽取3份样品进行检测，检测方法与均匀性相同。

（4）统计落入网格u′中数据点的数量，判断其是否满足 density（u′）≥ τ，若满足则将网格 u′标记为稠密网格，考察其余稀疏网格单元。图3为在二维空间中使用滑动网格方法进行网格修正。

1.3.1 菌种复活、鉴定与培养

从样品中随机选取9份样品，平均分成3组，分别由3个人独立完成检测，每瓶标准物质重复3次，以平板计数方法计数的平均值作为该批次质量监控样品定值的结果。

随机将我院2016年9月~2017年9月收治的90例肺炎患儿分为两组,每组45例。其中对照组男28例,女17例;年龄:10个月~9岁,平均年龄:3.18±0.54岁;病程:3~8d,平均病程:4.47±0.33d。观察组男27例,女18例;年龄:11个月~9岁,平均年龄:3.19±0.55岁;病程:3~9d,平均病程:4.46±0.35d。两组一般资料差异无显著性意义(P>0.05)。

2 结果与分析

2.1 质量监控样品的均匀性检验

采用单因素方差分析对单增李斯特菌质量监控样品进行均匀性检验。从表1、表2可以看出，F＜自由度为（f1，f2）及给定显著性水平α（通常α=0.05）的临界值Fα（f1，f2），表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。样品不均匀性所引起的误差与测量误差相比可以忽略不计，因此样品均匀性良好。

表1 质量监控样品的均匀性实验数据表

表2 质量监控样品均匀性实验数据单因素方差分析表

2.2 质量监控样品的稳定性检验

将2×3份样本结果的平均值（对数转换后）与均匀性检验结果（x-=3.641 lgCFU·mL-1）比较，之间的绝对差值除以应用该质量监控样品进行的质量控制活动中得到的能力评价用稳健标准偏差σ（σ=0.579），以比值小于0.3为原则确定样品要求的最长保存时间。表3稳定性检验的结果表明，样品在稳定性检验期间是稳定的，达到了作为质量监控样品的要求。

致力于成为中国一流的新型肥料供应商和农化服务商，艾力农公司与肥必施公司等多个知名企业及机构合作，通过引进和研发等多种模式不断为中国市场提供新型高效的肥料产品。深圳市艾力农生态发展有限公司总经理国士峰在讲话中表示，艾力农始终坚持以“科技创新、合作共赢、诚信高效、服务一流”为服务理念，以技术、服务与品牌打造企业发展根基。艾力农不断整合产品、专家、营销等多种资源，致力于引进世界优质肥料，顺应国家“减肥增效”的政策要求，进一步推动中国农业的高质量发展。国士峰也表示，艾力农将继续与行业内企业、经销商开展广泛的合作，共同提升行业发展水平，实现企、商、农各方的互利共赢。

表3 单核细胞增生李斯特菌质量监控样品的稳定性实验数据表

2.3 质量监控样品特性量值的确认

1.3.2 制备方法

通过对这些定理的证明、应用分析以及证明实施,寻求函数极限与数列极限的内在联系;给学生展示用数列极限处理函数极限有关问题的典型方法和技巧,特别是用数列极限证明函数极限不存在的典型方法和技巧，努力使学生对这些方法以及应用这些方法的技巧留下较深刻的印象，为学生逐步理解和掌握Heine归并原则,并为学生尝试应用这些原理所提供的思想和方法证明其他问题打下基础。

表4 单核细胞增生李斯特菌质量监控样品定值结果表

2.4 质量监控样品定值结果的不确定度评定

将单增李斯特菌标准菌株制备成麦氏浊度0.5的菌液，其余3种李斯特菌标准菌株制成麦氏浊度3的菌液作为背景菌，4种菌液各取1 mL添加到保护剂（生理盐水100 mL＋脱脂奶粉10 g＋乳糖8 g＋海藻糖5 g＋麦芽糊精5 g）中混合均匀，无菌条件下分装至预先灭菌西林瓶中冻干。主要参数：降温速度0.5 ℃·min-1、冷冻温度-40 ℃、加热温度10 ℃、冷阱温度-80 ℃、真空度10 bar。冻干后，对该质控样品均匀性和稳定性进行评价[12]。

2.4.1 测量影响因素的不确定度uA

质量监控样品稀释所用的量器分别为1 mL和10 mL的流出式分度移液管，根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[3]规定，其容量允差分别为±0.008 mL和±0.05 mL，故连续稀释所产生的相对不确定度为

从样品中随机选取12份样品，在重复条件下，即在同一实验室中由相同人员使用相同检测方法和设备在较短时间内检测2×12份样品。检测结果数据用单因素方差分析进行定量统计。

2.4.2 重复检测引起的不确定度uB

3位检测人员分别对9份质量监控样品进行检测，每份样品重复检测3次，具体数值参见表4，经计算重复检测引起的不确定度uB＝0.045 56。

2.4.3 合成不确定度u

企业财务数据是企业的高度保密数据，只有企业的高层以及企业财务管理人员才能接触到核心的财务数据，传统的财务管理模式下，企业的财务数据多以电子或纸质报表的形式呈现，这种“透明”的财务管理模式使得机密的财务数据面临着很大的泄漏风险。在互联网环境下，企业财务数据的信息化借助强大的计算机安全防护措施，如身份认证措施、计算机防火墙、用户密码登录等可以有效防控接触到机密财务数据的人员，有效隔绝非法人士对机密财务数据的获取，充分保证企业财务管理不受到恶意的侵犯。

合成不确定度计算为

通常取包含因子k=2，则对数均值扩展不确定度U=ku=2×0.236 8=0.473 6。则该质量监控样品中的单增李斯特菌的含量范围为103.6392±0.4736CFU·mL-1。

3 结论与讨论

随着《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）颁布实施，目前已制定了肉制品、冷冻饮品、部分乳制品中单核细胞增生李斯特菌的限量要求。由于《食品安全国家标准 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）中才加入了定量检测的方法，该项目的质量监控样品在国内尚属空缺。模拟真实样品，背景菌相对复杂的质量监控样品对于评价实验室检验检测的能力，有针对性地开展内外部质量控制活动具有非常积极的作用。本次实验制备的质量监控样品具有较好的稳定性，但总体的保护率和预期有一定的差距，可能与预冻过程中缺少对于降温速率的有效验证以及保护剂在冻干前的孵育时间有关。

测量不确定度是与测量结果相关联的参数，用于表征合理赋予被测量值的分散性。目前随着新版实验室认可准则的颁布实施，开展微生物定量检测测量不确定度评定，对客观分析检测数据结果具有十分重要的意义。此次检测结果的不确定度主要是由样本的重复检测、样本稀释、加样体积3方面产生的，其中重复性检测引入的不确定度是最主要的不确定度分量。可见严格控制操作环境、培养条件以及提高操作人员的技术能力，是降低不确定度分量重要且有效的措施。

(1)血管壁是药物传递到靶肿瘤组织的第一道屏障。然而，根据EPR的作用机制，大分子药物很容易从肿瘤血管泄漏处到达肿瘤组织间质。因此，肿瘤中的血管壁不作为高分子药物或纳米药物的屏障； 相反，它们促进大分子药物选择性地传递到肿瘤组织，成功将大分子药物输送到肿瘤细胞。

本次实验制备的质量监控样品，可作食品安全监管部门评价食品安全抽检监测承检机构实验室检验能力水平之用，亦可作为实验室自身开展内部质量控制活动的手段。通过开展相应质量控制活动，有效了解自身的技术能力，达到不断提高实验室相应的微生物检测能力的目的。