超高效液相色谱-串联质谱法检测食用菌中的游离棉酚

◎ 王乾丽，黄永桥，简银池，扶 胜，朱明燕

（1.贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550000；2.食品安全与营养（贵州）信息科技有限公司，贵州 贵阳 550000）

棉酚俗称棉毒素，是锦葵科棉属植物色素腺产生的多酚二萘衍生物[1]，易溶于丙酮、乙腈等有机溶剂[2]。研究表明，游离棉酚是一种神经性、血管性、细胞性有毒物质[3]，人们食用含有棉酚的食物后可引起低血钾症，损伤内脏器官以及可能导致不孕等症状[4-6]。我国是食用菌栽培生产大国，食用菌的培养基材料一般为有机废料或其副产品，如锯末、玉米秆、棉秆、果壳、茶副产品等，而棉籽壳作为万能的培养基被广泛应用于食用菌的栽培中，棉籽壳中含有大量的棉酚，食用菌在生长过程中会吸收富集棉籽壳中的游离棉酚，人们食用含有棉酚的食用菌后可能会影响身体健康。因此对食用菌中的游离棉酚进行检测具有重要的现实意义。

目前，关于研究食用菌中棉酚的检测方法较少，也未有相关的检测标准，棉酚检测方法采用比色法、分光光度法、高效液相色谱法等，以上方法存在方法选择性不强、操作复杂、基质干扰大，测定结果不准确的问题，高效液相色谱质谱联用法具有灵敏度高、准确度高、精密度好等特点，近几年也被广泛应用于棉酚的检测，研究较多的是棉酚在动物源食品、植物源食品、农副产品以及饲料中的检测，但采用超高效液相色谱-串联质谱法测定食用菌中的游离棉酚较少。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器与设备

Agilent 1290-6470超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，配有ESI源（美国Agilent公司）；搅拌机Blixer3（法国ROBOT COUPA公司）；LT2002电子天平（常熟市天量仪器有限公司）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）。

1.1.2 主要试剂

棉酚（纯度＞95%，上海安普实验科技股份有限公司）；丙酮（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，上海安普实验科技股份有限公司）；乙酸铵（分析纯、西亚试剂）；盐酸（优级纯，纯度36.0%～38.0%，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 标准溶液配制

精密称取10 mg棉酚（精确至0.01 mg）于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解混匀并定容至刻度线，配制成质量浓度为1 000.0 μg·L-1标准储备液，根据后续实验需要移取不同标准储备液于棕色容量瓶中，避光备用。

1.3 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Agilent公司）；流动相A：0.1%甲酸水（含2 mmol·L-1乙酸铵）溶液，流动相B：乙腈；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样体积：2.0 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相洗脱梯度表

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，负离子扫描；多反应监测；毛细管电压：4.5 kV；雾化器压力：40 psi；干燥气流速：10 L·min-1；干燥气温度：300 ℃；鞘气流速：10 L·min-1；鞘气温度：300 ℃；其他质谱条件见表2。

表2 质谱分析参数表

1.5 样品前处理

称取5 g（精确至0.01 g）捣碎后的组织样品于50 mL离心管中，准确加入15 mL丙酮-盐酸（0.5 mol·L-1）-水（13∶1∶6，v/v/v）混合溶剂，加入1粒陶瓷均质子，涡旋振荡20 min后离心，取出上清液，用10 mL提取液重复提取一次，用提取液定容至25 mL。静置片刻后，取上清液过0.22 µm PTFE滤膜，待测。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取液的选择

不同提取液的提取效率是不同的，提取液的选择除了要考虑目标化合物的理化性质外，还要考虑不同基质、提取量、提取环境等因素。张文华等[7]比较了丙酮和乙腈的提取效率，其中以丙酮-水混合溶剂的提取效果较理想。张静等[8]比较了游离棉酚在纯丙酮溶液、丙酮-水溶液、丙酮-磷酸溶液中的稳定性差异，其中丙酮水的变异系数较小，稳定性好。本文比较了丙酮-水（7∶3，v/v）、丙酮、丙酮冰乙酸、丙酮-盐酸-水（13∶1∶6，v/v/v）的提取效率。由表3可知，丙酮-水和丙酮-盐酸-水的提取效率较好，同时考虑棉酚为多酚化合物在偏酸性环境中降解不明显，稳定性高，因此本试验样品前处理提取液选定丙酮-盐酸-水。

表3 不同提取溶剂回收率比较表

2.1.2 提取液最佳盐酸浓度的选择

棉酚的稳定性受pH的影响，本实验就盐酸浓度对回收率的影响及其精密度进行了比较，将浓盐酸稀释成0.1 mol·L-1、0.2 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.8 mol·L-1和1.0 mol·L-1共5个浓度，与丙酮和水配制成丙酮-盐酸-水（13∶1∶6，v/v/v）的混合提取液，在空白香菇中添加2.5 ng·mL-1棉酚，用上述不同盐酸浓度的混合溶液提取，依次进样测定回收率，每个样品做平行试验6次。由表4可知，当盐酸浓度为0.5 mol·L-1时，回收率最高，随着盐酸浓度的增加，回收率开始降低，当盐酸浓度为1.0 mol·L-1时，回收率降至60.4%。

表4 不同盐酸浓度下香菇提取液的回收率实验结果表（n=6）

为选择更合适的提取液，本文选取阴性香菇样品，添加0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1共3个不同浓度棉酚，每个浓度分别用盐酸浓度为0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1、0.6 mol·L-1的丙酮-盐酸-水（13∶1∶6，v/v/v）混合提取液充分提取，3个盐酸浓度混合提取液的回收率都比较理想，盐酸浓度为0.5 mol·L-1时回收率略高，比较3个浓度的回收率精密度，当盐酸浓度为0.4 mol·L-1时各添加量的相对标准偏差为5.2%～8.9%，盐酸浓度为0.5 mol·L-1时各添加量的相对标准偏差为3.8%～6.1%，盐酸浓度为0.6 mol·L-1时各添加量的相对标准偏差为5.8%～9.8%，即盐酸浓度为0.5 mol·L-1时的回收率精密度较好，说明提取液为丙酮-盐酸（0.5 mol·L-1）-水（13∶1∶6，v/v/v）时，稳定性更好，见表5。

表5 3种不同盐酸浓度的回收率和精密度表（n=6）

2.2 方法学评价

2.2.1 方法的标准曲线、检出限、定量限

本方法采用基质工作曲线作为定量曲线对基质效应进行补偿，结果表明，棉酚在0.25～25.00 μg·L-1的质量浓度范围内相关系数（R2）大于0.997，方法的检出限（S/N=3）为1.0 μg·kg-1，定量限（S/N=10）为3.0 μg·kg-1，结果见表6。

表6 棉酚的线性范围、线性方程、相关系数（R2）、检出限及定量限表

2.2.2 加标回收及精密度考察

选取香菇、平菇和金针菇阴性样品，分别添加2 μg·kg-1、4 μg·kg-1、10 μg·kg-13个不同浓度的标准溶液，按照优化条件进行提取和分析。如表7所示，方法的平均回收率为86.1%～99.8%，相对标准偏差为2.3%～8.2%，结果表明该方法的准确度和精密度能够满足食用菌样品中痕量游离棉酚的含量测定。

表7 食用菌中样品的加标回收率和相对标准偏差表（n=6）

3 结论

本研究针对食用菌具有较强的基质效应及棉酚易氧化降解的特点，对前处理提取液进行了优化，建立了食用菌中游离棉酚残留量的分析检测方法。本实验的样品前处理步骤简单省时，具有易用性和较高分析效率，该方法回收率高，检出限低、灵敏度和重现性好，能够满足食用菌中痕量棉酚检测要求，为食用菌的安全监管提供可靠的技术支撑。