环磷腺苷反应元件结合蛋白在消化系统肿瘤中的作用△

石明连，朱政全，刘永明，苏何玲

桂林医学院智能医学与生物技术学院生物化学教研室，广西桂林 541004

转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein，CREB）属于DNA 结合蛋白碱性亮氨酸拉链（basic-region leucine zipper，bZIP）超家族成员，通过与基因启动子的环磷腺苷反应元件（cyclic adenosine monophosphate response element，CRE）结合，启动具有CRE 序列的靶基因转录，调控细胞分化、增殖、凋亡和代谢等生理过程。人CREB基因位于2 号染色体长臂33 区3 带，编码含有341 个氨基酸残基的蛋白。结构上，CREB 蛋白包含多个具有特定功能的结构域，其中bZIP 结构域介导CREB 二聚反应以及对CRE 的识别与结合，激酶诱导结构域（kinase inducible domain，KID）的9 个丝氨酸（Ser）残基是多种蛋白激酶磷酸化激活CREB 的位点，基本转录活性结构域与TATA-结合蛋白协同调控靶基因转录，而富含谷氨酰胺结构域则调控CREB 的转录活性。对CREB 结合位点的全基因组筛查提示超过4000 个基因受CREB调控[1]。实际上，CREB基因是原癌基因，CREB 是普遍性的转录激活因子。有研究应用结合了转录组学、秩次超几何分布重叠和染色质免疫沉淀测序等技术的系统分析方法揭示了与肿瘤有强相关性的CREB 靶基因，其中CREB 上调的靶基因29个，CREB 下调的靶基因20 个，并且CREB 对这些基因表达调控是非依赖环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的[2]。这表明CREB 不仅与肿瘤高度相关，而且在作为依赖cAMP 的转录激活因子的同时，也以非依赖cAMP 的方式对肿瘤细胞的生长发挥促进和抑制的双重作用。近年来，越来越多的研究指出CREB 在恶性肿瘤的发生发展中发挥非常重要的作用，其中消化系统肿瘤是研究热点。本文就CREB 在消化系统肿瘤中作用的研究进展进行综述。

1 CREB 与肝癌（liver cancer，LC）

在LC 的主要类型肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞中，CREB 的表达及其蛋白磷酸化水平均高于正常肝细胞[3]。磷酸化是CREB 激活的主要方式，磷酸化位点主要位于其KID 的9 个Ser 残基，其中Ser133 的磷酸化是CREB 激活的中心环节。CREB 磷酸化形成二聚体，然后与靶基因启动子的CRE 结合启动转录。在LC 细胞Huh7中，CREB 蛋白及其Ser133 磷酸化水平的降低可显著引发细胞的自噬[4]，而CREB 的激活则增强HCC浸润并与肿瘤的恶性发展相关[5]。CREB 高表达的HCC患者5年生存率显著低于CREB低表达患者[6]。

CREB 在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相关HCC 的发生中也起到促癌作用。机制上，这种促癌作用通过HBV 的非结构蛋白X 调节CREB 相关信号通路，包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）/CREB[7]、CREB/Yes 相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）[8]和CREB/微小RNA（microRNA，miRNA）-3188 信号通路[9]，或者调节CREB 与相关蛋白如中心体p4.1 相关蛋白（centrosomal p4.1-associated protein，CPAP）[10]和皮层肌动蛋白（cortactin，CTTN）[11]的表达和相互作用实现。

尽管越来越多的研究报道CREB 具有促癌作用，但促癌作用并非CREB 对HCC 的全部作用。Li 等[12]分析354 例确诊为HCC 患者的HCC 组织和癌旁正常组织标本发现，CREB/线粒体钙离子摄入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）低表达与不良临床结局相关，并导致不良预后。这提示CREB 对HCC 细胞生长也具有抑制作用。实际上，CREB 被发现在多种恶性肿瘤中发挥促癌和抑癌作用，而CREB 发挥促癌或者抑癌作用取决于其作用节点的前后关系[13]。如果CREB 的表达与激活以及由此产生的靶基因转录和信号通路的影响可以促进细胞增殖且抑制细胞自噬和凋亡，则CREB 发挥促癌作用，反之就是抑癌作用。

总之，对于HCC，已有的研究显示CREB 主要是促癌作用。CREB 及其磷酸化水平升高促进HCC 的发生发展。而且，HBV 相关HCC 也是HBV反式调节蛋白非结构蛋白X 通过影响CREB 相关信号通路的致癌结果。鉴于泛肿瘤研究指出CREB 具有促癌因子和抑癌因子双重性，因此，尽管目前只有个别研究报道CREB 对HCC 具有抑癌作用，但CREB 在HCC 发生发展的什么环节或者什么情况下发挥抑癌作用及其机制将是下一步值得关注的研究问题。

2 CREB 与食管癌（esophageal carcinoma，EC）

研究报道，CREB 对不同病理类型的EC 具有不同的影响。应用KMplot mRNA 基因芯片和RNA-seq analysis（https：//kmplot.com/analysis/）方法分析发现，CREBmRNA 的表达与肿瘤患者的生存率相关。CREB 表达升高和其Ser133 位点磷酸化可降低食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）患者的生存率，并且是肿瘤复发高风险因子。而CREB 高表达对于食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者则是生存有利因素[14-15]。

近年来，非编码RNA 与CREB 的相互作用在恶性肿瘤发生发展中的作用越来越受到关注。Yao 等[16]报道，miRNA-506 在EC 组织和细胞系中显著下调。体外分析发现，过表达miRNA-506 可抑制EC 细胞增殖，而抑制miRNA-506 表达则促进EC 细胞增殖。机制上，miRNA-506 是通过靶向CREB基因抑制CREB 转录活性，从而发挥抑制EC细胞增殖的作用。Su 等[17]研究指出，在EAC 细胞系中敲低长链非编码RNA LINC00857，可以抑制细胞增殖、集落形成、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡。同时，包括磷酸化CREB 在内的一些癌基因编码蛋白减少，提示CREB 参与LINC00857 对EAC的致癌作用。Luo 等[18]报道了CREB 与非编码RNA 相互作用影响EC 发生发展的另一种方式，CREB 和miRNA-133b 分别正向和负向调节β1，3-N-乙酰氨基葡糖转移酶2（β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 2，β3GNT2）的表达，形成β3GNT2 表达的调控环路。β3GNT2 在EC 组织中的表达升高，提示CREB 正向调控增强，β3GNT2 的高表达与EC 患者的不良预后相关。

值得注意的是，尽管高通量技术的基因表达分析显示CREB 的高表达对ESCC 患者的生存有利，但国内学者的研究指出，CREB 在ESCC 组织中过表达，并与患者的淋巴结转移和TNM 分期均呈正相关，下调CREB 的表达可抑制ESCC 细胞生长，诱导S期细胞周期停滞，引发细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭[19]。CREB磷酸化使转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）在ESCC 中表达上调，促进肿瘤新生血管生成和转移[20]。以上研究表明，CREB 的表达与磷酸化在ESCC 中同样发挥促癌作用。因此，CREB 在EC 中主要是促癌因子，而其抑癌因子的作用目前尚缺少实验依据。

3 CREB 与胃癌（gastric cancer，GC）

CREB 的表达与GC 患者的预后相关。高表达CREB的GC患者5年生存率显著降低[6]。Wang等[21]检测285 例原发性和转移性GC 组织以及非GC 胃黏膜组织的石蜡包埋标本发现，CREB 在GC 中高表达，且与GC 转移、肿瘤分期和不良预后相关。除了CREB 高表达对GC 具有促癌作用，CREB 的激活也促进GC 的发生发展。Koh 等[22]报道，β受体阻滞剂普萘洛尔抑制了MKN45 和NUGC3 两种GC 细胞的CREB 磷酸化激活并阻断其信号通路，从而抑制细胞增殖，诱导G1期细胞周期停滞和细胞凋亡。CREB 激活还与GC 的化疗耐药有关。Zhang 等[23]利用来自胃癌细胞系的Lgr5+干细胞研究CREB 的激活发现，抑制CREB 磷酸化导致ATP结合盒亚家族G 成员2（初级血型）[ATP binding cassette subfamily G member 2（junior blood group），ABCG2]这种多重药物转运蛋白的表达下调是顺铂耐药的原因之一。另外，Li 等[24]报道，GC 组织中线粒体核糖体蛋白L33（mitochondrial ribosomal protein L33，MRPL33）的短亚型表达上调可通过阻断磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）/CREB 信号通路，诱导细胞凋亡而促进表柔比星反应。而MRPL33 的长亚型则作用相反。

近年来，CREB 与非编码RNA 相互作用的研究揭示了诸多GC 发生发展的新机制。在GC 组织和细胞中高表达的CREB 通过抑制miRNA-186 的转录降低其对角蛋白8（keratin 8，KRT8）mRNA 的靶向作用，从而增加KRT8 对缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表达的上调作用，使KRT8/HIF-1α轴作用增强，促进GC 细胞生长并抑制凋亡[25]。而过表达miRNA-450a-5p 则通过下调CREB 抑制GC 细胞增殖、迁移和侵袭[26]。Zhuo等[27]报道了LINC00473 作为癌基因促进GC 发展的模式。LINC00473 一方面靶向水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）mRNA，并通过CREB 增强AQP3 表达，促进GC细胞增殖和迁移；另一方面作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）在细胞质中以海绵机制作用于miRNA-16-5p，缓解其对细胞周期蛋白D2（cyclin D2，CCND2）的抑制作用，从而增强LINC00473/miRNA-16-5p/CCND2 轴，促进细胞周期和GC 细胞增殖。Lai 等[28]报道，环状RNA（circular RNA，circRNA）0047905 作为ceRNA海绵化miRNA-4516 和miRNA-1227-5p，解除其对丝氨酸蛋白酶抑制剂家族B 成员5（serpin family B member 5，SERPINB5）和基质金属蛋白酶11（matrix metalloproteinase 11，MMP11）的抑制。SERPINB5 和MMP11 的过表达与GC 患者的不良预后相关。靶向下调circRNA0047905 可降低CREB 磷酸化，阻断GC 细胞的AKT/CREB 通路，但由此如何影响GC 的发展尚待研究。

4 CREB 与结直肠癌（colorectal cancer，CRC）

CREB 对维持CRC 细胞的恶性特征具有重要作用。Fujishita 等[29]报道，磷酸化CREB 在有肿瘤转移的CRC 小鼠和患者中表达。此外，cAMP/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/CREB 通路可上调CRC 肿瘤标志物白细胞激活黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM）和凸素1（prominin 1，PROM1），使CRC 维持肿瘤干细胞特性和转移潜能。敲除CREB基因将降低CRC细胞的肿瘤形成和转移起始能力。CREB 还通过调节靶基因葡萄糖转运体3（glucose transporter 3，GLUT3）[30]和核糖核苷酸还原酶调节亚基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2）[31]

的表达促进CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭。亚硒酸盐可通过阻断CREB 信号通路，在体外和体内抑制CRC 细胞中B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）引发的细胞凋亡。值得注意的是，尽管双嘧达莫被报道可以抑制肿瘤细胞的增殖，但在CRC 细胞HCT-8 中，双嘧达莫可能通过诱导CREB 磷酸化促进细胞的增殖[32]。

CREB与非编码RNA的相互作用在CRC细胞恶变中具有重要影响。其中miRNA-101、miRNA-134和miRNA-205 等miRNA 对CREB 的靶向作用可下调CREB 的表达，弱化CREB 信号通路，抑制CRC细胞增殖和迁移[33-35]。例外的是，miRNA-150 对CREB 信号通路的抑制则促进CRC 细胞的侵袭和迁移[36]，这种现象值得关注与深入研究。circRNA在CRC 中起到癌基因的作用。circ_0079993、circ_0136666、circ_002178 和circ_0006357 等circRNA 被报道促进CRC 细胞的增殖[37-40]。实际上，它们是作为ceRNA 以海绵机制分别作用于miRNA-203a-3p、miRNA-383、miRNA-542-3p 和miRNA-133b，消除其对CREB 的靶向作用，从而增强CREBmRNA 的稳定性和CREB 表达，促进CRC 的发展。非编码RNA 以miRNA 靶向下调CREB 表达，并以circRNA 作为ceRNA 海绵化消除miRNA 对CREB 的靶向下调作用是CREB 影响肿瘤发生发展的重要机制。

5 CREB 与其他消化系统肿瘤

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）中CREB 的表达影响肿瘤的发生发展。Song 等[41]报道，长链非编码RNA LINCO0857 通过间充质-上皮细胞转化（mesenchymal- epithelial transition，MET）上调CREB 和信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）的表达，促进PC 细胞的增殖，CREB 的激活促进PC 细胞生长。CREB 是锌依赖的转录因子，被锌转运蛋白4（zinc transporter 4，ZIP4）激活。Zhang 等[42]报道，PC 细胞中ZIP4 对CREB 的激活可增加具有癌基因功能的miRNA-373 的表达，进而下调肿瘤蛋白p53 可诱导核蛋白1（tumor protein p53 inducible nuclear protein 1，TP53INP1）、大肿瘤抑制因子激酶2（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）以及CD44 的表达，促进PC 的发展。胶原蛋白Ⅺα1（collagen type Ⅺalpha 1 chain，COL11A1）对CREB的激活是通过诱导AKT 磷酸化，提升CREB 的Ser133 水平，因此增强AKT/CREB 信号，并通过AKT/CREB/Bcl-2/Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）信号通路抑制线粒体跨膜功能，促进PC 细胞增殖并抑制其凋亡[43]。CREB 激活促进PC 转移，致癌蛋白Kirsten 鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）增加磷酸化激活的CREB 的Ser133 水平，CREB 的Ser133 与突变型p53和CREB相互作用，上调转移前先驱转录因子叉头框蛋白A1（forkhead box A1，FOXA1），激活其转录网络，驱动PC细胞的转移[44]。CREB 激活还与PC 患者的低生存率相关。Srinivasan 等[45]报道，烟草致癌物诱导的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）介导CREB 磷酸化，使吸烟者的CREB 激活水平显著升高，促进PC 细胞的生长，降低PC 患者的生存率。与上述CREB 磷酸化对PC 的影响相反，CREB 去磷酸化抑制PC 细胞的增殖。PH 域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2（PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase 2，PHLPP2）诱导CREB 去磷酸化，下调细胞周期蛋白D1（cyclin D1），抑制PC 细胞增殖。Wu 等[46]报道了CREB 亚型CREB3 对另一种消化系统肿瘤胆囊癌（gallbladder cancer，GBC）的作用。miRNA-181b 靶向CREB3 调节因子（CREB3 regulatory factor，CREBRF），解除其对CREB3 的抑制与降解作用，由此促进GBC 的病理性发展，并阻断抗肿瘤药物人参皂苷RG3 对GBC细胞增殖和肿瘤生长的抑制作用。现有研究资料表明，CREB在消化系统其他肿瘤中主要显示癌基因属性，其表达与激活促进肿瘤的发生发展，但其作用网络和作用机制则具有复杂性。

6 小结与展望

综上所述，CREB 在HCC、EC、GC、CRC 和PC等消化系统肿瘤中主要发挥促癌因子的作用。大多数情况下，消化系统肿瘤组织中CREB和p-CREB水平升高，并与细胞增殖、凋亡抑制和患者的不良预后相关。尽管目前有关CREB 在消化系统肿瘤中抑制肿瘤发生发展的报道较少，但由于泛肿瘤研究发现CREB 具有促癌因子和抑癌因子双重性，所以CREB 在消化系统肿瘤中发挥抑癌作用及其机制应该是未来值得关注的研究问题。近年来，CREB 与非编码RNA 相互作用对消化系统肿瘤细胞生长影响的研究报道快速增加，揭示了诸多新的CREB 相关促癌和抑癌机制，也为消化系统肿瘤提供了新的潜在诊断和预后标志，以及潜在靶点。肿瘤患者存在广泛的代谢异质性，因此对CREB 在肿瘤中作用网络和作用机制的深入研究可能产生复杂的结果，但对于精准和个性化的肿瘤治疗却十分必要。